利用DNA，RNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用，有望檢測生物標記物，診斷疾病和改善癌癥靶向治療。量化這些相互作用對于理解和控制其生物分子機制至關(guān)重要。多角度光散射(MALS)是一種強大的工具，可直接測量溶液中蛋白質(zhì)，核酸和復合物的摩爾質(zhì)量，無需熒光或放射性標記。

在這次訪談中，Sophia Kenrick博士與News-Medical Life Sciences討論了兩種互補的光散射技術(shù)，尺寸排阻色譜結(jié)合多角度光散射(MALS)和成分梯度MALS，為分析核酸提供了表征工具。以及核酸和蛋白質(zhì)之間的相互作用。

你能解釋研究蛋白質(zhì) - 核酸相互作用的重要性嗎?

目前開發(fā)用于治療多種疾病的生物治療劑基于廣泛的生物聚合物。通常，生物治療劑是工程化抗體，但現(xiàn)在所有種類的生物聚合物都用于生產(chǎn)治療劑?；贒NA和RNA的生物治療劑作為癌癥免疫療法和癌癥疫苗正變得越來越普遍。

這種治療的功效取決于將RNA遞送至免疫細胞并將其轉(zhuǎn)化為腫瘤靶向劑。交付方面對其功效至關(guān)重要。因此，我們必須了解所使用的生物聚合物的性質(zhì)以及它們?nèi)绾闻c其他生物化合物相互作用，以使它們盡可能有效。因此，生物物理特征是必不可少的。例如，遞送效率可能取決于聚合物與RNA結(jié)合的程度，或者純化過程可能會導致單鏈RNA形成您不想要的雙鏈體。

表征核酸與宿主蛋白或其他分子之間的相互作用對于理解健康和疾病狀態(tài)的潛在生物學也是至關(guān)重要的。獲取有關(guān)這些分子如何結(jié)合的詳細信息有助于我們了解結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，并通知敏感或高親和力生物傳感器的發(fā)展。

如何使用光散射來表征這種相互作用?

光散射研究可以提供關(guān)于這些復合物的大小，摩爾質(zhì)量和構(gòu)象的關(guān)鍵信息?？梢灾苯訙y量分子的摩爾質(zhì)量和與其結(jié)合配體的相互作用強度，而無需標記或摩爾質(zhì)量標準。這降低了人工制品的風險。

有幾種方法可以將光散射技術(shù)應(yīng)用于DNA和RNA表征。MALS，動態(tài)光散射和電泳光散射都可用于表征物理性質(zhì)，例如尺寸，分子量和電荷。

在案例研究中使用了哪種光散射技術(shù)?

兩個案例研究都使用多角度光散射或MALS。當激光指向溶液時，大部分光線一直通過，但是一些光線被溶液中的分子向各個方向散射。散射光的強度與摩爾質(zhì)量，濃度和折射率增量或dn / dc成比例。因此，通過測量光散射強度，您可以直接計算溶液中這些分子的摩爾質(zhì)量。

同時在多個角度測量光散射。這很重要，因為散射角的變化與該分子的大小成正比，可用于確定分子或粒子的半徑，這對于理解較大的DNA和mRNA分子至關(guān)重要。

第一個案例研究表明，通過分析溶液中存在的每種物質(zhì)，使用MALS和尺寸排阻色譜(SEC-MALS)來表征DNA和蛋白質(zhì)的復合物。第二個案例研究使用CG-MALS直接測量溶液中復合物的結(jié)合親和力和化學計量。

SEC-MALS如何用于生物復合物的研究?

有時，即使HPLC或UHPLC分離是理想的，僅基于洗脫時間估計的樣品的摩爾質(zhì)量與標準品的摩爾質(zhì)量不匹配。當樣品和標準品具有不同的密度和不同的構(gòu)象時，會出現(xiàn)這種不匹配。

在SEC-MALS中，來自HPLC或UHPLC柱的流出物流入UV檢測器，我們的多角度光散射檢測器和折射率(RI)檢測器。UV或RI檢測器提供濃度測量，其與MALS強度數(shù)據(jù)一起用于計算真實的摩爾質(zhì)量。MALS測量還通過揭示峰在摩爾質(zhì)量方面是否均勻或非均相來證實溶液已完全分離。

對于由兩種不同類型的分子組成的復合物，這種分析并不那么簡單。每個組件具有不同的消光系數(shù)和不同的dn / dc。在這種情況下，我們需要應(yīng)用“蛋白質(zhì)結(jié)合物分析”，其使用所有三種檢測器直接確定我們復合物中每種組分的量。

使用UV和RI檢測器測量濃度，得到每種組分的質(zhì)量分數(shù)和摩爾質(zhì)量。該技術(shù)有多種應(yīng)用，例如糖基化或聚乙二醇化蛋白質(zhì)，或用肽或核酸功能化的多糖。甚至可以表征非共價復合物，例如與膜蛋白質(zhì)相關(guān)的脂質(zhì)的量，或者在我們的情況下是蛋白質(zhì) - 核酸復合物。

這在SEC-MALS案例研究中如何應(yīng)用?

SEC-MALS和蛋白質(zhì)結(jié)合物分析方法已應(yīng)用于原型泡沫病毒(PFV)整合酶和病毒DNA的復合物，稱為intasome。

使用UV和RI同時獲得的PFV整合酶的消光系數(shù)幾乎是我們基于序列所預期的一半，但是用RI濃度和UV濃度測量摩爾質(zhì)量證實它是正確的。這已經(jīng)是關(guān)于有助于確定摩爾質(zhì)量的復合物的有用信息。

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接下來，使用光散射，UV和RI信號計算色譜圖中每個點的每個部分的摩爾質(zhì)量和質(zhì)量分數(shù)。

這表明蛋白質(zhì)部分約為90%，意味著90%的質(zhì)量是蛋白質(zhì)，約10%是DNA。根據(jù)這些信息，我們得到了整個復合體的dn / dc和整個復合體的消光系數(shù)。我們用這個濃度和這個dn / dc來計算摩爾質(zhì)量?？偰栙|(zhì)量為194千道爾頓，因此我們知道蛋白質(zhì)部分是174千道爾頓，DNA部分是約20千道爾頓。這相當于整合酶的四聚體和兩條與細胞結(jié)構(gòu)相匹配的DNA鏈。

觀察到峰的摩爾質(zhì)量不是恒定的，表明蛋白質(zhì)四聚體的解離可能在分離過程中發(fā)生或某些物質(zhì)可能不飽和。下一個案例研究顯示了我們?nèi)绾卧诮鉀Q方案中測量這些親和力和化學計量。

那么CG-MALS與SEC-MALS有何不同?

CG-MALS是一種技術(shù)，可以讓我們測量溶液中形成的配合物的親和力和化學計量。

與之前的案例研究不同，MALS適用于未分級的樣本。將一系列不同組成的樣品注入光散射和濃度檢測器中，以便我們可以使用MALS來確定每種組合物的摩爾質(zhì)量。然后，摩爾質(zhì)量的變化可以與溶液中絡(luò)合物的形成有關(guān)。

通過這種方式，我們可以評估單體和二聚體以及二聚體和三聚體之間的自締合和平衡。通過測量作為濃度函數(shù)的摩爾質(zhì)量，我們可以確定自締合親和力和化學計量。

如果沒有形成絡(luò)合物，則摩爾質(zhì)量將作為濃度的函數(shù)保持恒定。隨著二聚體和三聚體等復合物的形成，我們發(fā)現(xiàn)摩爾質(zhì)量隨濃度的增加而增加。使用適當?shù)哪Ｐ?，我們可以適應(yīng)這種增加，告訴我們關(guān)聯(lián)的親和力和化學計量。

相同的技術(shù)可以應(yīng)用于兩種不同物種之間的相互作用。該組合物僅包括不同濃度的兩種物質(zhì)。我們在每個物種過量時進行測量，因此我們可以對該相互作用的整個化學計量進行采樣。

隨著絡(luò)合物的形成，該溶液的摩爾質(zhì)量增加，產(chǎn)生特征曲線。結(jié)合的復合物越多，相互作用越強。這使得峰值更高且更清晰。

此外，峰的位置告訴我們?nèi)芤旱幕瘜W計量。如果物種B具有物種A的一個結(jié)合位點，我們將看到峰摩爾比為1：1的頂點。如果每個B可以結(jié)合兩個A分子，我們將看到摩爾比為2：1的最大值，依此類推。

此外，由于CG-MAL技術(shù)直接測量摩爾質(zhì)量，我們可以分辨出1：1和2：2相互作用之間的差異。它們都會在同一位置達到最大值，但我們?nèi)匀豢梢詤^(qū)分，因為2：2復合物的摩爾質(zhì)量是兩倍。

在您的第二個案例研究中使用CG-MALS研究了哪個復合體?

CG-MALS用于研究與loxP DNA識別位點復合的Cre重組酶。

首先，我們使用Cre的濃度梯度來測量單獨的蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量并確定它是否自我關(guān)聯(lián)。對DNA本身進行了類似的測試。對五種不同濃度的每種分子進行MALS測量。

每個分子的摩爾質(zhì)量在整個濃度范圍內(nèi)沒有增加，表明它們根本不是自締合的。Cre給出恒定摩爾質(zhì)量為39千道爾頓，這與單體一致，并且DNA摩爾質(zhì)量測量為恒定的23千道爾頓，其也是單體。

然后研究酶和DNA之間的關(guān)聯(lián)。在MALS流動池中分析13種不同濃度的蛋白質(zhì)和DNA的混合物。隨著Cre / loxP絡(luò)合物的形成，光散射強度的增加與摩爾質(zhì)量隨時間的增加成比例。

發(fā)現(xiàn)平衡時的摩爾質(zhì)量約為110千道爾頓。這立刻告訴我們，化學計量比大于1：1，因為39加23只是62。

峰值位于2：1結(jié)合比的正確位置，但摩爾質(zhì)量仍然大于這種復合物的應(yīng)用，表明形成了一些更高級的結(jié)構(gòu)，而不是標準的1：1或2： 1復雜。這得到了DNA與蛋白質(zhì)的高比例的曲率的支持，該蛋白質(zhì)未被簡單的2：1模型捕獲。

摩爾質(zhì)量的測量表明實際上存在三種不同的絡(luò)合物。第一個是與DNA結(jié)合的Cre蛋白，這種第一個結(jié)合發(fā)生的平衡解離常數(shù)為170納摩爾。

然后第二個Cre以合作的方式與該復合物結(jié)合。一旦一種Cre蛋白與DNA結(jié)合，對第二種Cre蛋白的親和力就會增加。最后，該Cre-loxP雜四聚體以400納摩爾的親和力二聚化。

單個CG-MALS實驗探索每種物種僅幾百納摩爾的濃度，因此使我們能夠完全描述這種三步結(jié)合機制。

沒有必要在多種濃度方案中工作或假設(shè)這些結(jié)合位點中的一個或多個完全飽和，或者該反應(yīng)的一部分可忽略不計。只需一次實驗，您就可以獲得完整的表征并測量所有特征。

您不僅可以獲得親和力和化學計量，而且CG-MALS還可以為您提供每種混合物的溶液組成。

您能否簡要介紹兩個案例研究?

是的，希望，我還表明光散射，無論是分餾還是分批模式，都不僅僅適用于蛋白質(zhì)。這些相同的分析對于DNA和RNA以及用于表征與其他分子復合的核酸是至關(guān)重要的。

這兩個案例研究強調(diào)了使用MALS可以獲得的類似蛋白質(zhì)/ DNA系統(tǒng)的兩種不同類型的特征。

具有蛋白質(zhì)綴合物分析的SEC-MALS給出了與其DNA配體結(jié)合的病毒整合酶的絕對摩爾質(zhì)量和蛋白質(zhì)和DNA部分。這是在沒有摩爾質(zhì)量標準的情況下完成的，并且沒有假設(shè)化學計量學。

在沒有色譜的分批模式下CG-MALS允許我們在多步蛋白質(zhì)/ DNA相互作用中量化該復合物的親和力和化學計量。相互作用分析不需要標記或固定。

我們的讀者可以去哪里了解更多信息?

如需了解更多信息，請訪問我們的網(wǎng)站 -www.wyatt.com/SEC-MALS和www.wyatt.com/CG-MALS。

關(guān)于Sophia Kenrick

Sophia Kenrick博士是Wyatt Technology的高級應(yīng)用科學家，她支持Wyatt儀器的多種應(yīng)用，特別是在分子識別和生物分子相互作用領(lǐng)域。

Sophia擔任分析服務(wù)總監(jiān)和圣巴巴拉校區(qū)光散射大學院長。

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