許多未培養(yǎng)的微生物在調(diào)節(jié)地球的生物地球化學(xué)過程中扮演著不為人知的角色; 從調(diào)節(jié)植物健康到在陸地和海洋環(huán)境中驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)，這些過程都可能影響全球氣候。雖然研究人員正在利用多種方法來識別這些被稱為“微生物暗物質(zhì)”的微生物，并確定它們正在做什么，但大多數(shù)技術(shù)都不允許它們同時進(jìn)行這兩種微生物。

在一項(xiàng)研究在線發(fā)表2016年6月28日，在國家科學(xué)學(xué)院院刊(PNAS)，研究人員在加利福尼亞技術(shù)學(xué)院(加州理工學(xué)院)和能源部聯(lián)合基因組研究所，美國能源部(DOE JGI)的美國能源部辦事處科學(xué)用戶設(shè)施，利用最近改進(jìn)的技術(shù)來識別個體活躍細(xì)胞，以及微生物群落內(nèi)的活躍細(xì)菌和古細(xì)菌的單個聚類。了解地球微生物多樣性的真實(shí)范圍是DOE感興趣的，以便了解如何利用它們來應(yīng)對各種能源和環(huán)境挑戰(zhàn)。

“探索微生物暗物質(zhì)的最大問題之一是到目前為止，確定何時未培養(yǎng)的微生物具有代謝活性以及它們在系統(tǒng)中的生態(tài)功能是非常復(fù)雜的，”研究第一作者Roland Hatzenpichler說，他是一名博士后研究員在微生物生態(tài)學(xué)家Victoria Orphan的加州理工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室工作。作為DOE生物與環(huán)境研究(BER)計(jì)劃的一部分，Orphan的實(shí)驗(yàn)室一直在研究未培養(yǎng)微生物的生態(tài)學(xué)和生理學(xué)，催化環(huán)境中甲烷的厭氧氧化。“當(dāng)我們處理生活在復(fù)雜社區(qū)內(nèi)的環(huán)境或寄主相關(guān)生物 - 通常同時發(fā)生數(shù)千種或更多種 - 時，很難確定個體物種或細(xì)胞的作用。從歷史上看，這已經(jīng)使用單細(xì)胞分辨同位素標(biāo)記完成。這是一種相對繁瑣且昂貴的方法，但是非常具體和敏感。但是，如果我們想要更好地了解微生物組的功能，我們需要新的，互補(bǔ)的方法，這些方法具有更高的吞吐量，可以并行化，而且價格便宜。BONCAT [新技術(shù)]就是這樣一種方法。“

BONCAT：了解微生物體功能的高通量技術(shù)

短為乙 IO ø rthogonal Ñ導(dǎo)通Ç anonical 甲美濃酸?agning，BONCAT是加州理工學(xué)院開發(fā)的用于生物工程研究的技術(shù)，但由Hatzenpichler和Orphan改編用于微生物生態(tài)學(xué)研究。BONCAT使用合成氨基酸標(biāo)記蛋白質(zhì)制造細(xì)胞。然后可以用熒光標(biāo)簽染色這些氨基酸，點(diǎn)亮其棲息地中的活性細(xì)胞。在這項(xiàng)研究中，Hatzenpichler及其同事使用從俄勒岡州和加利福尼亞州海岸外的深海甲烷滲漏沉積物中收集的沉積物樣本進(jìn)行了一系列孵化實(shí)驗(yàn)，追蹤甲烷代謝細(xì)菌和古菌種群的緩慢生長。這些沉積物中的微生物群落包括甲烷氧化古菌的聚集體，稱為ANME(用于AN有氧ME)(生物多樣性)和硫酸鹽還原菌(SRB)共生共存，有助于去除海洋沉積物釋放的80%甲烷。

加州理工學(xué)院的研究人員將BONCAT與熒光原位雜交(FISH)相結(jié)合，分析這些模擬環(huán)境中的活性微生物，并確定它們在哪些條件下具有活性。“通常情況下，每個甲烷滲漏點(diǎn)都有幾個不同的古菌甲烷氧化劑，”Hatzenpichler說。“一個長期存在的假設(shè)是，來自這些群體的不同成員在不同時期的活動不同。通過利用以相對高通量模式進(jìn)行BONCAT分析的能力，我們發(fā)現(xiàn)所有甲烷氧化古菌群的成員在孵化過程中具有合成代謝活性?，F(xiàn)在我們可以開始問為什么了。“

應(yīng)用BONCAT技術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)

然后，DOE JGI研究人員幫助開發(fā)了一個流程，使團(tuán)隊(duì)能夠?qū)ONCAT應(yīng)用于流式細(xì)胞儀。“這與單細(xì)胞基因組學(xué)相同，但對于共生細(xì)菌和古細(xì)菌的聚集，”DOE JGI微型應(yīng)用小組負(fù)責(zé)人Rex Malmstrom稱該技術(shù)稱為BONCAT-FACS(BONCAT - F luorescence - A ctivated C ell S奧廷)。“我們正在對單個聚合體進(jìn)行分類，這些聚集體中充滿了在模擬環(huán)境中活躍的細(xì)胞，并且通過細(xì)胞分選儀，我們可以抓取活性細(xì)胞來研究它們。我們必須弄清楚如何調(diào)整流式細(xì)胞儀的過程。在分選后，我們對單個聚集體進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后對16S rRNA標(biāo)記基因進(jìn)行測序以鑒定包含聚集體的細(xì)胞。我們現(xiàn)在正在對這些樣本進(jìn)行全基因組測序。“測序可以為研究人員提供遺傳信息，解釋為什么有些微生物在某些條件下是活躍的，為什么其他微生物不是。

通過BONCAT-FACS，研究小組發(fā)現(xiàn)，甲烷氧化古菌并不像已經(jīng)預(yù)期的那樣只與已知的硫酸鹽還原菌相互作用，但有時也與研究較少的Verrucomicrobia門的成員聯(lián)系起來。之前沒有發(fā)現(xiàn)過這些相互作用，研究結(jié)果表明，甲烷氧化古菌具有比人們想象的更廣泛的共生關(guān)系。目前正在解決這些相互作用是否對兩種細(xì)胞類型都有益的問題。

“JGI的主要力量在于破譯微生物遺傳密碼的能力，”Hatzenpichler指出。“通過合作，我們能夠從樣本中分離出與溫室氣體甲烷降解有關(guān)的單個細(xì)胞群，確定參與該過程的細(xì)胞伙伴，并深入了解其遺傳密碼。”Orphan和她的團(tuán)隊(duì)計(jì)劃利用配對的甲烷氧化古菌和細(xì)菌伴侶的基因組信息，深入了解不同甲烷氧化菌群在環(huán)境中共存的相互作用和能量交換的生理學(xué)和機(jī)制。

秋季，Hatzenpichler將在蒙大拿州立大學(xué)博茲曼分校開設(shè)自己的實(shí)驗(yàn)室。他將繼續(xù)與DOE JGI研究人員密切合作，揭示未培養(yǎng)微生物的生物地球化學(xué)影響和生物技術(shù)潛力。

這項(xiàng)工作得到了美國國家科學(xué)基金會暗能生物圈研究中心，戈登和貝蒂摩爾基金會，奧地利科學(xué)基金和美國能源部科學(xué)辦公室的支持。