目錄

第一章緒論……………………………………………………………………………一１

１．１膠原蛋白概況…………………………………………………………………．１

１．１．１膠原蛋白的結(jié)構(gòu)…………………………………………………………１

１．１．２膠原蛋白的分布及來源…………………………………………………１

１．１．３膠原蛋白的提取方法及多肽的制備……………………………………２

１．２膠原蛋白的應(yīng)用與研究現(xiàn)狀…………………………………………………．２

１．２．１膠原蛋白在食品、醫(yī)藥中的應(yīng)用………………………………………２

１．２．２膠原蛋白在美容和品中的應(yīng)用……………………………………３

１．２．３膠原蛋白的研究現(xiàn)狀……………………………………………………４

１－３本論文的選題意義及主要研究?jī)?nèi)容…………………………………………．６

第二章羅非魚皮酶法脫脂工藝條件的優(yōu)化…………………………………………．．７

２．１材料與試劑……………………………………………………………………．７

２．２儀器與設(shè)備……………………………………………………………………．７

２．３實(shí)驗(yàn)方法及內(nèi)容………………………………………………………………．７

２．３．１羅非魚皮基本成分的測(cè)定………………………………………………７

２．３．２羅非魚皮中膠原蛋白含量的測(cè)定………………………………………７

２．３．３魚皮膠原蛋白的提取工藝流程…………………………………………８

２．３．４羅非魚皮脫脂率的測(cè)定…………………………………………………９

２．３．５羅非魚皮酶法脫脂單因素實(shí)驗(yàn)…………………………………………９

２．３．６羅非魚皮酶法脫脂工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化…………………………．１０

２．３．７脫脂羅非魚皮膠原蛋白提取率的測(cè)定………………………………．１０

２．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析………………………………………………………………１０

２．４．１羅非魚皮基本成分……………………………………………………１０

２．４．２羅非魚皮酶法脫脂單因素實(shí)驗(yàn)…………………………………………１１

２．４．３羅非魚皮酶法脫脂工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化…………………………．１３

２．４．４脫脂羅非魚皮膠原蛋白提取率………………………………………．１７

２．５本章小結(jié)………………………………………………………………………１７

第三章羅非魚皮膠原蛋白的理化性質(zhì)研究…………………………………………１９

３．１材料與試劑……………………………………………………………………１９

３．２儀器與設(shè)備……………………………………………………………………１９

３．３實(shí)驗(yàn)方法及內(nèi)容………………………………………………………………１９

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

３．３．１羅非魚皮膠原蛋白的氨基酸組成……………………………………１９

３．３．２膠原蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳……………………………………．１９

３．３．３膠原蛋白的紫外光譜掃描……………………………………………２０

３．３．４膠原蛋白熱變性溫度（Ｔｄ）的測(cè)定……………………………………一２０

３．３．５膠原蛋白的溶解性實(shí)驗(yàn)………………………………………………．２０

３．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析………………………………………………………………２１

３．４．１羅非魚皮膠原蛋白的氨基酸組成……………………………………．２１

３．４．２膠原蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳……………………………………．２１

３．４．３膠原蛋白的紫外光譜掃描……………………………………………．２２

３．４．４膠原蛋白熱變性溫度（Ｔｄ）的測(cè)定……………………………………一２３

３．４．５膠原蛋白的溶解性實(shí)驗(yàn)………………………………………………．２４

３．５本章小結(jié)………………………………………………………………………２５

第四章羅非魚皮膠原蛋白多肽的制備及性質(zhì)………………………………………２６

４．１材料與試劑……………………………………………………………………２６

４．２儀器與設(shè)備……………………………………………………………………２６

４－３實(shí)驗(yàn)方法及內(nèi)容………………………………………………………………２６

４．３．１梯級(jí)多肽的制備………………………………………………………．２６

４．３．２魚皮膠原多肽水分含量測(cè)定…………………………………………．２７

４．３．３魚皮膠原多肽灰分含量測(cè)定…………………………………………．２７

４．３．４魚皮膠原多肽總蛋白含量測(cè)定………………………………………．２７

４．３．５魚皮膠原蛋白多肽純度測(cè)定…………………………………………．２７

４．３．６魚皮膠原多肽平均分子量分布的測(cè)定………………………………．２７

４．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析………………………………………………………………２８

４．４．１膠原蛋白多肽水分含量………………………………………………．２８

４．４．２膠原蛋白多肽灰分含量………………………………………………．２８

４．４．３膠原蛋白多肽總蛋白含量……………………………………………．２９

４．４．４膠原蛋白多肽的純度…………………………………………………．２９

４．４．５多肽平均分子量分布…………………………………………………．２９

４．５本章小結(jié)………………………………………………………………………３０

第五章羅非魚皮膠原蛋白及多肽對(duì)小鼠皮膚的護(hù)膚功效…………………………３ｌ

５．１材料與試劑……………………………………………………………………３１

５．２儀器與設(shè)備……………………………………………………………………３ｌ

５－３實(shí)驗(yàn)方法及內(nèi)容………………………………………………………………３１

５．３．１膠原蛋白及多肽涂抹實(shí)驗(yàn)……………………………………………．３１

ＶＩＩ

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

５．３．２鼠皮的制備……………………………………………………………．３２

５．３－３小鼠皮膚角質(zhì)層含水量的測(cè)定………………………………………．３２

５．３．４小鼠皮膚白度的測(cè)定…………………………………………………．３３

５．３．５小鼠皮膚組織形態(tài)的觀察和成肌纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)……………………．３３

５．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析………………………………………………………………３７

５．４．１膠原蛋白及多肽對(duì)小鼠皮膚角質(zhì)層水含量的影響…………………．３７

５．４．２膠原蛋白及多肽使用對(duì)小鼠皮膚白度的影響………………………．３９

５．４．３膠原蛋白及多肽對(duì)小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響………………………．４１

５．５本章小結(jié)………………………………………………………………………４４

第六章結(jié)論與展望……………………………………………………………………４５

６．１結(jié)｛侖……………………………………………………………………………………………………．４５

６．２展望……………………………………………………………………………４５

參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………………４７

攻讀學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果清單………………………………………………５２

ＶⅡＩ

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

插圖清單

圖２．１溫度對(duì)羅非魚皮脫脂率的影響……………………………．．１１

圖２．２ｐＨ對(duì)羅非魚皮脫脂率的影響…………………．……．．……１２

圖２．３加酶量對(duì)羅非魚皮脫脂率的影響……………………………１２

圖２．４脫脂時(shí)間對(duì)羅非魚皮脫脂率的影響…………………………．１３

圖２．５脫脂時(shí)間與脫脂溫度對(duì)脫脂率的影響………………………．．１６

圖２．６脫脂溫度與加酶量對(duì)脫脂率的影響…………………………．１６

圖２．７脫脂時(shí)間與加酶量對(duì)脫脂率的影響…………………………．１６

圖３．１羅非皮膠原蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳譜圖………………………．２２

圖３．２羅非魚皮膠原蛋白紫外吸收光譜……………………………２３

圖３．３羅非魚皮膠原蛋白熱變性曲線……………………………．．２４

圖３．４羅非魚皮膠原蛋白溶解度曲線……………………………．．２４

圖５．１涂抹液液處理后鼠皮膚角質(zhì)層紅外掃描圖……………………．３８

圖５．２小鼠皮膚組織切片………………………………………４３

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萬(wàn)方數(shù)據(jù)

表格清單

表２．１Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表…………………．１０

表２．２羅非魚魚皮基本化學(xué)組成（以濕基計(jì)）………………………１０

表２．３響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果……………………………………．１４

表２．４方差分析表…………………………………………．．．１４

表３．１羅非魚皮膠原蛋白氨基酸組成……………………………．．２１

表４．１膠原蛋白多肽水分含量…………………………………．．２８

表４．２膠原蛋白多肽灰分含量…………………………………．．２８

表４．３膠原蛋白多肽的總蛋白含量………………………………．２９

表４．４膠原蛋白多肽純度…．．…．．……………．………．………２９

表４．５膠原蛋白多肽平均分子量分布……………………．………．３０

表５．１鼠皮組織梯級(jí)脫水流程…………………………………．．３４

表５．２鼠皮組織透明化流程……………………………………．３５

表５．３鼠皮組織浸蠟時(shí)間……………………．………．………．３５

表５．４蘇木紫染流程………………………………………．．３６

表５．５伊紅染流程…………．………………………………３６

表５．６鼠皮組織切片透明化流程表………………………………．３７

表５．７小鼠皮膚角質(zhì)層吸光度之比………………………………．３９

表５．８小鼠涂抹不同配方溶液皮膚顏量值………………………．．４０

表５．９小鼠皮膚切片組織形態(tài)特征………………………………．４ｌ

Ｘ

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

第一章緒論

第一章緒論

本章主要從膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、分布及來源、提取及制備方法三個(gè)方面介

紹膠原蛋白的基本知識(shí)，在充分了解膠原蛋白的研究以及應(yīng)用現(xiàn)狀后，確立

本篇論文立題依據(jù)及實(shí)驗(yàn)方法。

１．１膠原蛋白概況

１．１．１膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

膠原蛋白（也稱膠原，ｃｏｌｌａｇｅｎ），是一種細(xì)胞外的不溶性蛋白質(zhì)，常以

纖維形式存在于動(dòng)物體組織中。原膠原是膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)單元，是一種

由三條多肽鏈扭曲旋轉(zhuǎn)形成的螺旋結(jié)構(gòu)【ｌ】。膠原蛋白種類較多，目前已被發(fā)

現(xiàn)的膠原蛋白有１９種，膠原樣蛋白１０種以上。膠原蛋白肽鏈?zhǔn)怯砂被釟?/p>

基之間通過形成肽鍵鍵合而成。螺旋盤繞的肽鏈結(jié)構(gòu)中，每條肽鏈本身又具

有特殊的左手螺旋結(jié)構(gòu)ｆ２】。膠原蛋白中富含甘氨酸和脯氨酸，甘氨酸含量達(dá)

到總氨基酸殘基的３３％，脯氨酸則接近２５％１３１，因此甘氨酸和脯氨酸被當(dāng)作

膠原蛋白的特征氨基酸。膠原蛋白中酪氨酸殘基含量很少，并且?guī)缀醪缓?/p>

氨酸和半胱氨酸。膠原分子包含的三條肽鏈，具有約１０００個(gè)氨基酸殘基，

每條肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量在１００千道爾頓左右，所以膠原分子的相對(duì)分子質(zhì)量

約３００干道爾頓【４Ｊ。

１．１．２膠原蛋白的分布及來源

膠原蛋白在生物體中含量多、分布廣，從水母、海綿等簡(jiǎn)單多細(xì)胞生物

到線蟲、蚯蚓等低等脊椎動(dòng)物，再到高等的哺動(dòng)物機(jī)體組織中，都含有一

定量的膠原蛋白［５１。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)主要組分之一，是哺動(dòng)物體內(nèi)含量

最多的一類蛋白質(zhì)。膠原蛋白主要分布在生物體的骨骼，牙齒，皮膚，韌帶

和結(jié)締組織、內(nèi)臟間質(zhì)等部位中，并使相應(yīng)組織具有特定的機(jī)械強(qiáng)度以支撐

器官、保護(hù)機(jī)體［１１。陸生哺動(dòng)物豬、牛、羊等的皮膚、骨骼中含有大量的

膠原蛋白，是目前工業(yè)生產(chǎn)膠原蛋白的主要來源。但近年來由于陸生動(dòng)物源

傳染病、宗教忌諱以及豬、牛、羊類產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)產(chǎn)生的碳排放比雞、魚產(chǎn)

品高出５０％，出于減少碳排放等環(huán)境保護(hù)要求【６】，以及水產(chǎn)生物加工副產(chǎn)品

中如魚皮、魚鱗、魚眼、魚鰭、烏賊類的皮和頭蓋軟骨、章魚皮、鮑的肌肉

和外套膜等中膠原蛋白含量相對(duì)豐富，因此成為膠原蛋白新的提取來源ＨＪ。

膠原蛋白最常見的分類方式是根據(jù)是否具有周期性橫紋膠原原纖維，將

膠原蛋白分為原纖膠原蛋白和非原纖膠原蛋白【８］。原纖膠原蛋白包括Ｉ、ＩＩ、

萬(wàn)方數(shù)據(jù)