[資源共享]藍(lán)白斑篩選原理及問題總結(jié)

1問題：做轉(zhuǎn)化時，用藍(lán)白斑篩選，以獲得陽性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍(lán)白斑篩選，有什么區(qū)別嗎？藍(lán)白斑

篩選有什么作用嗎？

對于這一問題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長。理論上說，當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞

才能生存繁殖。藍(lán)白篩選是驗(yàn)證是否有插入片斷。兩者結(jié)合起來，更有利于篩選到我們的目的菌。

2問題：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒有可能是載體自連的？

答：可以說，世界上沒有絕對的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，長出來的白斑也不一定都是含有插入片段的陽性克隆，

具體原因可能有：

1）有可能是載體自連的假陽性；

2）作時AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。

3）有時即使插入片段也會出現(xiàn)籃斑。只要編碼框沒被破壞。

3問題：如何篩選重組菌落?

答：可使用藍(lán)/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白，未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株為藍(lán)。

4問題：藍(lán)白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?

答：如進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，宿主菌β-半糖苷酶的α-肽編碼區(qū)應(yīng)在染體或附加體上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都

能用于藍(lán)/白斑篩選。

5問題：在藍(lán)白斑篩選的過程中沒有藍(lán)斑是什么原因?qū)е碌?？因?yàn)橥ㄟ^PCR檢測插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒有插

入片段。

答：原因很多，1）可能是你用的培養(yǎng)基含有糖或葡萄糖，因?yàn)榘胩歉拭笗纸馓?，?dǎo)致不能與X-Gal反應(yīng)，葡萄糖不會

誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。2）作時AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。3）很多因素會造成PCR失敗。

6問題：我最近轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，通過藍(lán)白斑篩選，挑出白菌落做PCR，可是在電泳時發(fā)現(xiàn)在有目的帶的同時還有比目的帶

小的雜帶，不知為什么？我反復(fù)篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應(yīng)該下一步怎么做？

答：針對這樣的情況，我覺得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你應(yīng)該檢測PCR過程有沒有問題。

7問題：我用Amp-IPTG-X-galLB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒一個藍(lán)斑，挑幾個白斑搖菌擴(kuò)增后PCR

檢測也全是陽性克隆，不會全都重組成功了吧？什么原因呢？

答：這樣的情況是完全有可能的，只要載體處理的好，應(yīng)該說是有這種可能。

藍(lán)白斑篩選原理：

藍(lán)白斑篩選是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的

DNA的短區(qū)段，其中有β-半糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克

隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編

碼β-半糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶

學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-

互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍(lán)菌落，因而易于識別。然而，

當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白

菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，

有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白菌落。

IPTG與X-Gal介紹

IPTG即Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，也稱Isopropylβ-D-thiogalactoside，中文名為異丙基-β-D-硫代半糖苷。分子

式為C9H18O5S，分子量為238.30，CASNumber367-93-1，UltraPure，dioxanefree，常用于藍(lán)白斑篩選，如果在平板培養(yǎng)基

中加入X–Gal和IPTG，由于β–半糖苷酶的α–互補(bǔ)性，可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組

體。此外，它還可以作為具有l(wèi)ac或tac等啟動子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。

IPTG與X-Gal配置

X-Gal：中文名為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半糖苷。X-Gal是β-半糖苷酶(β-galactosidase)的顯底物,在β-半糖苷酶的催化下

會產(chǎn)生藍(lán)產(chǎn)物。常用于β-半糖苷酶的原位染檢測以及藍(lán)白斑篩選。

IPTG配制成24mg/ml（100mM）的水溶液，并進(jìn)行過濾除菌后保存。

X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半糖苷。用二基甲酰胺DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙

烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。

使用方法：

在100ml的瓊脂培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)基溫度為55℃左右時，加入100μl的24mg/ml（100mM）IPTG、200μl的X-Gal（20mg/ml）

和100μl的Amp（100mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。

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