卞圈哪沖?２０１１?２?科技　??。臁?　

一例奶牛發(fā)生牛支原體肺炎的診斷　

胡長敏　，彭清潔１，３，陳穎鈺１，２，巴曉亮１’２，自智迪　，郭愛珍　

（１．華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢４３００７０；２．華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢４３００７０；　

３．國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室，武漢４３００７０）　

中圖分類號：￥８５８．２３文獻標識碼：Ａ文章編號：１００４—４２６４（２０１?。保埃病埃埃埃薄埃场?/p>

摘要：牛支原體是嚴重影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的重要病原。２００８年我們報道牛支原體導(dǎo)致“肉牛傳染性牛支原體肺　

炎”以來，主要在肉牛發(fā)現(xiàn)該病。本文從臨床出現(xiàn)類似癥狀的運輸后發(fā)病奶牛采集樣本，經(jīng)細菌培養(yǎng)和支原體　

培養(yǎng)、特異性ＰＣＲ擴增和１６Ｓ?。颍遥危翜y序等病原學檢測證實為牛支原體感染。　

關(guān)鍵詞：牛支原體；奶牛；感染；呼吸系統(tǒng)疾病　

牛支原體（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ?。猓铮觯椋螅┦歉腥九５囊环N　

公司。按照文獻［４１配制支原體液體與固體培養(yǎng)基，但　

重要病原，除導(dǎo)致牛肺炎、腺炎外．還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、　培養(yǎng)基中未加１％醋酸鉈溶液?！?/p>

角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種?。保臣毦姆蛛x培養(yǎng)　

疾病【ｌ１。在過去的兩年中，我們確診了數(shù)十起肉牛的　

按文獻嘲取小塊組織樣本切面涂抹ＴＳＡ平板，　

牛支原體肺炎圜，發(fā)病牛都在不久前經(jīng)歷過長途運輸?！?/p>

劃線接種，３７ｃ【＝恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。菌落線培養(yǎng)后。用革　

近期湖北某奶牛場新購人９ｌ頭奶牛，部分出現(xiàn)發(fā)燒、　蘭氏染和油鏡觀察進行形態(tài)學初步鑒定?！?/p>

流涕、咳嗽、伴腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀，就診時已死?。保础〖毦模保叮印。颍遥危凌b定　

亡１５頭。經(jīng)實驗室確診為牛支原體肺炎，現(xiàn)就該奶　無菌牙簽挑取單個菌落，加入裝有適量滅菌水　

牛場臨床發(fā)病與病原學鑒定情況報告如下?！?/p>

的無菌離心管中，煮沸１０ｒａｉｎ，冰?。保恚椋?，１２?。埃埃埃颍恚椋睢?/p>

１材料與方法　離心３０ｓ，取上清作為ＤＮＡ模板，按照本實驗室建　

１．１　樣品　立的方法，用１６Ｓ?。颍遥危镣ㄓ靡镞M行ＰＣＲ擴增【３Ｊ．　

湖北某地奶牛場無菌采集并送檢的奶牛肺臟、　所得ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆至ｐＭＤ一１８Ｔ載體中．　

喉及氣管樣品３份?！?/p>

送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果　

１．２培養(yǎng)基　

與ＧｅｎＢａｎｋ中的相應(yīng)序列進行同源性比對．確定菌　

胰蛋白胨大豆瓊脂（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ?。樱铮帷。粒纾幔颍裕樱粒≈觇b定結(jié)果?！?/p>

胰蛋白胨大豆肉湯（Ｔｒｙｐｔｉｃ?。樱铮。拢颍铮簦?，ＴＳＢ）培養(yǎng)基　

１．５牛支原體分離培養(yǎng)　

購自ＢＤ公司。按照試劑說明配置ＴＳＡ固體培養(yǎng)基　

分別將小塊肺組織樣本、氣管拭子、喉拭子涂　

及ＴＳＢ液體培養(yǎng)基。類胸膜肺炎（Ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ—　

于ＰＰＬＯ固體培養(yǎng)基表面，于含５％ＣＯ　的細胞培養(yǎng)　

ｌｉｋｅ?。铮颍纾幔睿椋螅恚?，ＰＰＬＯ）肉湯粉、酵母粉、瓊脂粉等購　箱中培養(yǎng)；同時將小塊組織樣本投入到ＰＰＬＯ液體培　

自ＢＤ公司，ＭＥＭ培養(yǎng)基購自Ｓｉｇｍａ公司．馬血清購　

養(yǎng)基中。２～３ｄ后，用光學顯微鏡低倍觀察菌落形態(tài)　

自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，精氨酸購自上海伯奧生物科技有限　

支原體在固體培養(yǎng)基上菌落具有“煎蛋樣”典型特　

收稿日期：２０１０—０９一Ｏ７　

征，液體培養(yǎng)基由紅變?yōu)辄S，并且透亮。　

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體￣（ｎｙｃｙｔ）ｒ＿３８）建設(shè)專項資金資助。　

１．６牛支原體的ＰＣＲ鑒定　

作者簡介：胡長敏（１９７７一），男，湖北宜昌人，講師，博士，研究方向為　

奶牛疾病　

用本實驗室鑒定的牛支原體ＰＣＲ方法進行鑒　

通訊作者：郭愛珍?！《ǎ瑫r將ＰＣＲ產(chǎn)物克隆至ｐＭＤ一１８Ｔ載體中，進行　

?２?　

測序分析ｌ?。常臁！?/p>

１．７藥敏試驗　

利用藥敏紙片法（購于杭州天河微生物試劑有　

限公司）檢測敏感藥物。取純化菌落接種于ＴＳＢ液　

體培養(yǎng)基中，３７℃震蕩培養(yǎng)過夜，制備固體營養(yǎng)瓊脂　

平皿，在瓊脂表面均勻涂布菌液，將環(huán)丙沙星、恩諾　

沙星、氧氟沙星、頭孢拉定、慶大霉素、丁胺卡那霉素、　

四環(huán)素、紅霉素、磺胺、桿菌肽藥敏紙片貼在培養(yǎng)基　

表面，置于３７℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ｈ后觀察結(jié)果?！?/p>

用游標卡尺量取抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片說明書　

判定抗生素的敏感度。支原體藥敏試驗的培養(yǎng)條件　

同支原體分離培養(yǎng)，其余步驟同細菌的藥敏試驗?！?/p>

２結(jié)果與分析　

２．１發(fā)病牛的臨床癥狀　

畜主反映，９１頭泌奶牛分５次從山東省威海　

市山縣運到湖北紅安縣，運輸距離１　１００公里。首次　

運牛時間是２０１０年４月５?。牛簦院箨懤m(xù)運牛。牛運　

回半月左右發(fā)病，至５月１３日共死亡奶牛ｌ５頭，死　

亡率達１６％。第３車牛運輸時遇下雨，途中淋雨十多　

個小時，牛到場后第４天開始發(fā)病，發(fā)病率與死亡　

率均較其他批次更高。　

發(fā)病初期體溫升高至４１～４２ｃＣ，患牛精神沉郁，　

食欲急劇下降甚至廢絕，反芻減少或停止，部分?！?/p>

伴有陣發(fā)性咳嗽并流清亮鼻液。嚴重者呼吸困難、張　

口呼吸；大多數(shù)牛出現(xiàn)腹瀉，少數(shù)牛糞便帶血；另外　

部分牛出現(xiàn)跗關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)腫脹，跛行、不愿行走等　

癥狀；病程稍長的患牛表現(xiàn)消瘦?！?/p>

２．２病理變化　

病死牛剖檢變化主要集中在肺部?；寂７闻K尖　

葉、心葉及部分膈葉的局部有紅肉變區(qū)和大量壞　

死灶散在分布：在病灶集中部位進行橫切和縱切，　

可見切面濕潤，輕輕擠壓見膿樣液體流出（圖１）；肺　

臟切塊投入水中后即沉入水底；從肺細支氣管內(nèi)可　

擠出粘液或粘液樣分泌物，肺門淋巴結(jié)腫脹、出血；　

氣管及喉內(nèi)有泡沫樣分泌物，氣管壁及喉壁出血、　

充血（圖２）?！?/p>

２－３　細菌分離鑒定結(jié)果　

牛肺組織中培養(yǎng)獲得一種邊緣光滑、濕潤、圓形　

透明的菌落。革蘭氏染后，顯微鏡下觀察為革蘭　

氏陰性短桿狀細菌．擴增該菌的１６Ｓ　ｒＲＮＡ．測序分　

中固螞才?２０１１?２?科技　

圖１　肺組織買變及壞死　圖２氣雷充血、出血。見大量泡沫　

析后確定為大腸桿菌。　

２．４支原體的分離結(jié)果　

對該樣品肺組織、喉拭子、氣管拭子等病料接　

種液體及固體支原體培養(yǎng)基，接種喉拭子的平板上　

出現(xiàn)典型的“煎蛋樣”外觀的菌落（圖３）。取培養(yǎng)的　

支原體菌落進行特異性ＰＣＲ擴增，獲得陽性條帶，　

略小于２５０ｂｐ，與理論值２３８ｂｐ相符（圖４）。進一步　

進行１６Ｓ　ｒＲＮＡ測序分析，確定為牛支原體?！?/p>

ｂＤ?。汀。薄。病?/p>

２０００　

１０００　

７５０　

５００　

２５０　

２３８　

１０Ｏ　

圖３?。停猓铮觯椋蟮模校茫覕U增結(jié)果　一　圖４喉拭子牛支原體　

Ｉ：Ｍ．ｂｏｖｉｓ擴增產(chǎn)物：２：陰性對照：　“煎蛋樣”外觀　

Ｍ：ＤＬ?。玻埃埃啊。模危痢。停幔颍耄澹颉?/p>

２．５藥敏試驗結(jié)果　

藥敏試驗結(jié)果顯示，該牛場所感染的支原體較　

敏感的抗菌藥為菌必冶、多黏菌素Ｂ及先鋒Ｖ；卡那　

霉素、壯觀霉素、青霉素、氨芐等表現(xiàn)為中度敏感；　

而常規(guī)抗生素對致病菌與支原體完全不敏感。　

３討論與結(jié)論　

３．１　牛支原體是感染牛的一種非常重要但又容易　

被忽視的病原，可以導(dǎo)致犢牛生長緩慢，成年?！?/p>

泌量降低或引起多個器官的炎癥問。牛支原體大　

都與巴氏桿菌、金黃葡萄球菌、化膿鏈球菌等感　

染相伴發(fā)：另外，牛支原體可與呼吸道合胞體病毒、　

傳染性鼻氣管炎病毒或牛病毒性腹瀉病毒伴發(fā)。在英　

國所調(diào)查中的５５個牛場中，有半數(shù)牛場檢測到牛支　

原體特異性抗體，但是僅７個牛場檢測到呼吸道合胞　

體病毒、鼻氣管炎病毒或牛病毒性腹瀉病毒抗體　?！?/p>

瑞士牛支原體導(dǎo)致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道　

卞圈碼斗?２０１１?２?科技　

疾病的５０％Ｉ６１。在所有牛呼吸系統(tǒng)病原的混合感染　

中．牛支原體的感染居于首位　，９１。　

?３?　

支原體?。Ｕ衔覈B(yǎng)牛業(yè)的健康快速發(fā)展?！?/p>

參考文獻　

３．２在牛支原體病治療藥物的選擇上，由于不同牛　

場病?；疾∏闆r、病程、混合感染或繼發(fā)感染情況　

［１】Ｎｉｃｈｏｌａｓ?。摇。?，Ａｙｌｉｎｇ?。摇。摹。停悖铮穑欤幔螅恚帷。猓铮觯椋螅海洌椋螅澹幔螅?，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ（ｏｎｔｒｏｌ　

［Ｊ１．Ｒｅｓ?。郑澹簟。樱澹椋玻埃埃?，７４（２）：１０５一ｌ１２．　

【２］石磊，龔瑞，尹爭艷，等．肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷ｌＪ＿．華　

中農(nóng)業(yè)大學學報，２００８，２７（４）：５７２　各異，很難確定一個統(tǒng)一的治療方案。石磊等通過　

藥敏試驗證實環(huán)丙沙星等藥物對部分支原體菌株　

敏感１３１，另有報道認為早期使用泰樂菌素類藥物或　

土霉素也有一定效果　”。堅持早診斷、早治療，把握　

動物臨床用藥原則、嚴格用藥量及用藥療程、不濫　

［３】石磊，龔瑞，尹爭艷，等．肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的診斷【Ｊｌｌ華ｃ　農(nóng)　

業(yè)大學學報，２００８，２７（５１：６２９—６３３．　

ｆ４１中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準委員會．中華人民共和國國家標　

準——牛傳染性胸膜肺炎（牛肺疫）診斷技術(shù)ＧＢ／ＴＩ８６４９２２００２［Ｓ］．北京：　

中國標準出版社，２００２．　

【５］中華人民共和圍衛(wèi)生部醫(yī)政司全國臨床檢驗操作規(guī)程ｌＭ］．南京：東南　

大學出版社，２００６．　用抗生素，可以在一定程度上控制牛支原體肺炎?，F(xiàn)　

階段尚無有效的牛支原體疫苗，研究證實，牛支原　

體病通常在牛饑餓、寒冷、長途運輸?shù)葢?yīng)激狀態(tài)下　

更易發(fā)生　，避免牛的長途運輸、切實改善飼養(yǎng)環(huán)境　

和營養(yǎng)條件，提高牛的抗病力，是預(yù)防牛患支原　

【６?。校铮酰恚幔颍叮剩幔簟。?，Ｌｅ?。牵颍幔睿洹。?，Ｐｈｉｌｉｐｐｅ?。樱澹簟。幔保牛妫妫椋悖幔悖。铮妗。螅穑澹悖簦椋睿铮恚悖椋睢。幔纾幔椋睿螅簟?/p>

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ?。猓铮觯椋蟆。椋睿洌酰悖澹洹。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。悖铮睿觯澹睿簦椋铮睿幔欤欤。颍澹幔颍澹洹。悖幔欤觯澹蟆荆剩辍。?/p>

Ｖｅｔ?。停椋悖颍铮猓椋?，２ｏ０１，８０（１ａ）：２３—３５．　

［７】　Ｂｕｃｈｖａｒｏｖａ?。伲郑澹螅螅澹欤椋睿铮觯帷。粒希睢。簦瑁濉。幔澹簦椋铮穑幔簦猓铮纾澹睿澹螅椋蟆。铮妗。停悖铮穑欤幔螅欤帷?/p>

ｐｎｅｕｍｏｎｉａ?。椋睢。悖幔欤觯澹螅郏剩荩粒颍悖琛。牛稹。郑澹簦澹颍椋睿幔颍恚澹?，１９８９，４３（５）：６８５—６８９．　

［８】　Ｎｉｃｈｏｌａｓ?。摇。痢。剩薄。祝铮铮洹。牛拢幔耄澹颉。?，ｅｔ　ａ１．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ?。椋螅铮欤幔簦澹洹。妫颍铮怼?/p>

ｒｕｍｉｎａｎｔｓ?。椋睢。拢颍椋簦幔椋睢。保梗梗担玻埃埃埃校铮觯澹洌帷。省。拢疲澹颍睿幔睿洌澹。粒疲颍澹。?，ｅｔ?。幔臁。?/p>

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ?。铮妗。颍酰恚椋睿幔睿簦螅海穑幔簦瑁铮纾澹睿椋悖椋簦?，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ?。幔睿洹?/p>

體病的關(guān)鍵所在?！?/p>

牛支原體病是嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染性疾病，　

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?。纾澹睿澹簦椋悖螅郏茫荩拢颍酰螅螅澹欤螅海牛酰颍铮穑澹幔睢。茫铮恚恚椋螅螅椋铮睿玻埃埃保海薄。保叮保玻埃?/p>

【９］冉智光，謝建華，駱璐，等．我國部分地區(qū)牛支原體肺炎和關(guān)節(jié)炎的病原體　

診斷ｆＪ１．中國預(yù)防獸醫(yī)學報．２０１０，３２（１）：４０—４３．　

【１０】康云．肉牛支原體肺炎的診斷?。校危桑剩桑竽痢～F醫(yī)．２０１０，２９（１）：１３０．　

本文是我國牛支原體導(dǎo)致奶牛支原體肺炎的首次　

報道。現(xiàn)階段國內(nèi)外缺乏有效的防治牛支原體的方法，　

亟需加強牛支原體免疫原性、致病機制等方面的研　

究，積極開發(fā)有效的診斷試劑及疫苗，有效防控?！?/p>

［１１】Ｃａｓｗｅｌｌ?。省。?，Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔ?。停停澹铮穑欤幔螅恚帷。猓铮颍椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。悖幔簦簦欤濉?/p>

Ａｎｉａ?。簦龋澹幔欤簦琛。遥澹蟆。遥澹觯玻埃埃?，８（２）：１６ｌ—ｌ?。福丁?/p>

Ａ?。茫幔螅濉。遥澹穑铮颍簟。妫铮颉。停悖铮穑欤幔螅恚帷。拢铮觯椋蟆。校睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢。模幔椋颍。茫铮鳎蟆?/p>

ＨＵ?。茫瑁幔睿纾恚椋睢保校牛危恰。眩椋睿纾辏椋濉?，ＣＨＥＮ　Ｙｉｎｇ—ｙｕ　。。，ＢＡ?。兀椋幔铩欤椋幔睿纭?。，ＢＡＩ?。冢瑁椤洌椤。牵眨稀。粒椤瑁澹睢?。　

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ?。铮妗。郑澹簦澹颍椋睿幔颍。停澹洌椋悖椋睿澹龋酰幔瑁铮睿纭。粒纾颍椋悖酰欤簦酰颍幔臁。眨睿椋觯澹颍螅椋簦?，Ｗｕｈａｎ　４３００７０；２．Ｔｈｅ　Ｓｔａｔｅｄ?。耍澹。蹋幔猓铮颍幔簦铮颍。铮妗。粒纾颍椋悖酰欤簦酰颍幔臁?/p>

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ?。矗常埃埃罚?；３．Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｂｅｅｆ?。茫幔簦簦欤濉。桑睿洌酰螅簦颍椋幔臁。裕澹悖瑁睿铮欤铮纾。樱螅簦澹?，Ｗｕｈａｎ　４３００７０）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ?。猓铮颍椋蟆。椋蟆。幔睢。椋恚穑铮幔睿簟。穑幔簦瑁铮纾澹睢。悖幔酰螅椋睿纭。纾颍澹幔簟。欤铮螅蟆。椋睢。悖幔簦簦欤濉。椋睿洌酰螅簦颍樱椋睿悖濉。玻埃埃浮。鳎瑁澹睢。停猓铮觯椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋帷。椋睢?/p>

ｂｅｅｆ　ｗａｓ?。妫椋颍螅簦欤。颍澹穑铮妫欤澹洹。椋睢。茫瑁椋睿幔簦瑁椋蟆。洌椋螅澹幔螅濉。鳎幔蟆。恚幔椋睿欤。洌椋螅悖铮觯澹颍澹洹。椋睢。猓澹澹妗。悖幔簦簦欤澹桑睢。簦瑁椋蟆。穑幔穑澹?，ｔｈｅ　ｄａｉｙ?。悖幔簦颍簦欤濉。幔妫簦澹颉。颍澹悖澹睿簟?/p>

ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ?。鳎幔蟆。椋欤臁。幔睿洹。瑁幔洹。螅椋恚椋欤幔颉。螅恚穑簦铮怼。簦铩。猓铮觯椋蟆。穑睿澹酰恚铮睿椋幔裕瑁濉。穑幔簦瑁铮纾澹睢。椋洌澹睿簦椋椋悖幔簦椋妫铮睢。鳎幔蟆。穑澹颍妫铮颍恚澹洹。猓。悖酰欤簦酰颍澹校茫摇?/p>

ｂｏｒｉｓ．　ａｎｄ?。薄。叮印。颍遥危粒裕瑁濉。颍澹螅酰欤簦蟆。洌澹恚铮睿螅簦颍幔簦澹洹。簦瑁幔簟。簦瑁濉。洌椋螅澹幔螅濉。鳎幔蟆。悖幔酰螅澹洹。猓?/p>

Ｋｅｙ?。鳎铮颍洌螅海停悖铮穑欤幔螅恚帷。猓铮觯椋?；Ｄａｉｙ?。悖幔簦颍簦欤?；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ