幾乎人體中的每一個細胞，從心臟細胞到細菌吞噬免疫細胞，都是由被稱為線粒體的專門細胞器產(chǎn)生的化學能量驅動的。能量產(chǎn)生過程會產(chǎn)生高毒性的廢物，因此，與真正的發(fā)電廠一樣，這些細胞器需要嚴格的質量控制和監(jiān)督。

這種生死攸關的任務確保了細胞及其所屬生物的存活。細胞能夠去除受損線粒體的能力與從癌癥到神經(jīng)退行性疾病 - 特別是帕金森病 - 的病癥有關，其中耗電的神經(jīng)元非常容易受到有缺陷的線粒體的毒性作用的影響。

在4月19日出版的“分子細胞”雜志上，哈佛醫(yī)學院的科學家們報告說，他們開發(fā)了一種新技術，以前所未有的定量精度分析細胞如何通過細胞自噬或“自食”系統(tǒng)開始去除有缺陷的線粒體。該方法允許他們首次研究源自干細胞的人類神經(jīng)元中的這一過程。

通過將蛋白質景觀的“數(shù)字快照”作為細胞標記受損的線粒體進行自噬，研究團隊生成了迄今為止該過程動態(tài)的最清晰圖像，包括蛋白質修飾反應的絕對測量及其豐度和隨時間的變化。

作者說，這些結果為詳細研究線粒體損傷，細胞死亡和疾病之間的聯(lián)系奠定了基礎，并建立了一種技術方法，可用于揭示許多其他環(huán)境中有缺陷的細胞通路的機制。

高級研究報告作者J. Wade Harper說：“如果有一種針對這種途徑的藥物以治療帕金森病或其他神經(jīng)退行性疾病為目標，我們將需要這種程度的細節(jié)來了解候選藥物的工作原理。” ，HMS Bert和Natalie Vallee分子病理學教授和細胞生物學系主任。

用于線粒體質量控制的分子報警系統(tǒng)涉及兩種酶：蛋白激酶PINK1，其用磷酸鹽化學修飾蛋白質;和泛素連接酶PARKIN，其用稱為泛素的分子標記靶蛋白。

在正常情況下，健康的線粒體在其外表面上攜帶很少的PINK1。然而，當受損時，線粒體會積累PINK1，將磷酸鹽轉移到PARKIN以激活它。

一旦激活，PARKIN將泛素轉移到各種不同的蛋白質上，在線粒體表面形成“泛素外殼”。當達到一定的泛素閾值時，觸發(fā)細胞“自食”機器的募集，導致線粒體的降解。

PINK1和PARKIN的突變已經(jīng)通過大量研究與帕金森氏病相關聯(lián)，帕金森氏病涉及某些神經(jīng)元的死亡和大腦中不正確折疊的蛋白質的累積。研究人員在描述PINK1-PARKIN途徑方面取得了很大進展，但其許多關鍵特征仍然知之甚少。

剪裁大衣

已知遍在蛋白在氨基酸賴氨酸的特定殘基上標記其靶蛋白。然而，這僅發(fā)生在一小部分賴氨酸殘基上，并確切地確定了哪些賴氨酸被修飾以及為什么對該領域是一個挑戰(zhàn) - 特別是對于線粒體表面上的十幾個PARKIN靶標。此外，這些目標的豐度尚不清楚，這可能會影響泛素化過程。

哈珀實驗室以前與HMS細胞生物學教授Steve Gygi合作開展的工作已經(jīng)建立了一些方法，可以檢測與泛素相關的蛋白質中的單個賴氨酸殘基。

研究小組在當前的研究中擴展了這種方法。由主要作者，細胞生物學HMS研究員Alban Ordureau帶頭，他們開發(fā)了一種新方法-PAPIN目標 - 平行反應監(jiān)測(Pt-PRM) - 以前所未有的細節(jié)水平評估參與線粒體質量控制的蛋白質泛素化的前景。

他們還創(chuàng)建了一個參考肽庫，使他們能夠測量受損線粒體上PARKIN靶標的精確豐度和個體泛素化事件。

從本質上講，參考肽庫使研究人員能夠在質譜儀中同時以十二種線粒體表面蛋白的位點特異性方式“計數(shù)”泛素化事件。

當與線粒體損傷后的時間依賴性測量相結合時，該方法產(chǎn)生線粒體表面泛素化事件的“數(shù)字快照”，不僅揭示了修飾的位點特異性，而且還提供了線粒體景觀的定量圖像。

通過包括檢測PINK1依賴性磷酸化事件的參考肽，該團隊還能夠將靶磷酸化與泛素化相結合。

“這是迄今為止對泛素通路進行的最詳細的分析之一。沒有其他研究使用這種復雜程度來分析這樣的過程，”哈珀說。

數(shù)碼快照

新技術允許對蛋白質泛素化事件進行準確，絕對的測量，與之前的非定量方法形成鮮明對比，不提供泛素化 - 位點特異性。

“這種方法現(xiàn)在為我們提供了完整的動態(tài)范圍，”哈珀說。“我們可以測量超過三個數(shù)量級，以更好地了解動力學，化學計量學，空間組織，與磷酸化的整合以及許多其他特征，”哈珀說。

通過提高精確度，該團隊對來自遺傳修飾的人類干細胞的神經(jīng)元中的天然泛素化相關事件進行了首次定量分析，該系統(tǒng)與人類疾病研究相比，與以前的模型相關。

這包括對多巴胺能神經(jīng)元的分析，其喪失是帕金森病的主要特征，與哈佛大學干細胞和再生生物學教授李魯賓合作完成。到目前為止，該領域的大多數(shù)研究都是在永生化人類癌細胞(HeLa)上進行的，這些細胞被設計成以非常高的水平表達PARKIN，以便科學家們可以測量它們的活動。

Harper，Ordureau及其同事在他們的分析中比較了兩種細胞模型，確定了修飾事件的特異性和時間的相似性和差異。他們還在蛋白質上發(fā)現(xiàn)了特異性賴氨酸殘基，這些殘基在神經(jīng)元中被選擇性地泛素化，但在HeLa細胞中沒有，反之亦然。這組作者說，這些差異的生物學意義仍然未知，并且是進一步研究的目標。

這些分析有助于揭示該領域目前存在爭議的問題，例如泛素鏈是否不加思索地標記線粒體上的蛋白質，或者它們是否精確定位特定的蛋白質。

答案可能是“取決于”。一般來說，泛素化似乎隨著蛋白質的豐富而擴大，但研究人員也發(fā)現(xiàn)了選擇性的證據(jù)，特別是在目標蛋白質中的某些結構元素內。

實驗系統(tǒng)的穩(wěn)健性還允許作者檢查該途徑的幾個機制方面，包括例如確定PINK1在干細胞衍生的神經(jīng)元中的PARKIN磷酸化的作用。

“我們想知道這些機制是如何起作用的，因為我們希望能夠將它們作為藥物發(fā)現(xiàn)的目標，或者找到繞過病人致病突變的方法，”Ordureau說。“我們現(xiàn)在可以非常詳細地分析神經(jīng)細胞中的這一關鍵過程，并在一次實驗中大規(guī)模地進行分析。使用以前的方法，你必須進行數(shù)十次實驗才能獲得相似或不太準確的結果。”

他們的新方法的功效現(xiàn)在能夠改進PINK1-PARKIN途徑的研究及其在帕金森病等疾病中的作用，如PINK1小分子活化劑的研究所證明。作者說，該方法還可以用于揭示其他系統(tǒng)和疾病中缺陷通路的機制。

“泛素化是細胞用來去除受損或不需要的成分以保持自身健康和完整性的基本機制，”哈珀說。“它不僅與線粒體有關，而且與細菌，蛋白質聚集體和其他細胞器的去除有關。這項技術可用于揭示許多不同系統(tǒng)的生物化學。”