來(lái)自不同領(lǐng)域的PIPPI科學(xué)家正在開發(fā)方法，工具和數(shù)據(jù)庫(kù)，以指導(dǎo)合理配制強(qiáng)大的蛋白質(zhì)療法。他們的總體目標(biāo)是開發(fā)一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)指導(dǎo)產(chǎn)品配方的開發(fā)。

動(dòng)態(tài)光散射(DLS)是用于高通量聚集篩選的主要生物物理技術(shù)，PIPPI廣泛使用。

在接受News-Medical和Life Sciences的采訪時(shí)，Lorenzo Gentiluomo詳述了用于評(píng)估穩(wěn)定性的各種DLS方法，包括一些新穎的應(yīng)用。他還解釋了DLS等高吞吐量技術(shù)的發(fā)展如何極大地增加了查找數(shù)據(jù)模式的機(jī)會(huì)以及機(jī)器學(xué)習(xí)在此過(guò)程中的作用。

你能解釋光散射在PIPPI研究中的作用嗎?

PIPPI聯(lián)盟正在編制一個(gè)包含18種代表性蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以表征成功配方開發(fā)的關(guān)鍵屬性。它將包括24種配方的基本特征，作為鹽濃度和pH的函數(shù)。此外，一些配方將進(jìn)行更深入的分子表征，其中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性與溶液行為有關(guān)。

這項(xiàng)工作的一個(gè)重要部分是使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和靜態(tài)光散射(SLS)研究蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。我們使用Wyatt的DynaPro Plate Reader測(cè)量蛋白質(zhì)相互作用，該讀數(shù)器具有溫度控制的微孔板。

DynaPro Plate Reader可以對(duì)蛋白質(zhì)的大小，分子量和相互作用進(jìn)行DLS和SLS測(cè)量，從而很好地理解蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性?？梢源_定尺寸，分子量，多分散性，粘度和相互作用參數(shù)，然后確定配方條件和溫度。

我們通過(guò)遵循平移擴(kuò)散系數(shù)k D的濃度依賴性，使用DLS測(cè)量蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。通過(guò)同時(shí)測(cè)量SLS，我們還可以確定成對(duì)分子間相互作用的強(qiáng)度，即第二維里系數(shù)A 2或B 22。這提供了一種對(duì)膠體穩(wěn)定性配方進(jìn)行分級(jí)的好方法。

有兩種理論用于描述成對(duì)蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)分子間相互作用。我更喜歡使用接近能量框架，即反映距離依賴性的勢(shì)能差異。增加離子強(qiáng)度可以屏蔽電荷 - 電荷相互作用，并且應(yīng)該提供更快的聚集，因?yàn)榉肿痈菀紫嗷プ饔谩?/p>

擴(kuò)散相互作用參數(shù)k D已經(jīng)表明它是配方的關(guān)鍵生物物理特性; 它不僅是蛋白質(zhì)相互作用的衡量標(biāo)準(zhǔn)。最近對(duì)抗體制劑的k D測(cè)量揭示了k D與制劑的表觀溶解度，熱穩(wěn)定性，流變學(xué)和靜電性質(zhì)之間的關(guān)系。

您對(duì)蛋白質(zhì)的哪些特性有所描述?

我們將18種蛋白質(zhì)的24種制劑表征為pH和離子強(qiáng)度的函數(shù)，然后應(yīng)用計(jì)算屏幕，計(jì)算具有相對(duì)分子描述符的24種不同制劑中的每一種中蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)。從篩選中，我們收集了一系列產(chǎn)出。一些來(lái)自通過(guò)DLS進(jìn)行的應(yīng)力測(cè)定以及通過(guò)與多角度光散射(SEC-MALS)結(jié)合的尺寸排阻色譜法。

一個(gè)重要的參數(shù)是暴露于熱應(yīng)力時(shí)的聚集模式，因?yàn)檫@可以使我們更好地理解配方開發(fā)過(guò)程中解決問題的需要。為了評(píng)估蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，測(cè)量聚集作為pH和離子強(qiáng)度的函數(shù)。使用相同濃度的緩沖液，但加入不同量的鹽以改變離子強(qiáng)度。通過(guò)SLS測(cè)量聚集發(fā)生的溫度(T agg)。應(yīng)該注意的是，T agg并不總是與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)，因?yàn)榫奂梢栽诘鞍踪|(zhì)開始展開之前發(fā)生(由內(nèi)在熒光確定)。

聚合模式可以告訴您蛋白質(zhì)的行為方式。例如，如果聚集在兩個(gè)步驟中發(fā)生，其間存在平臺(tái)，這表明蛋白質(zhì)最可能在單體和復(fù)合物之間具有平衡 - 它不僅與溫度有關(guān)。

我們還使用光散射來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用以及它如何隨著不同的離子強(qiáng)度而變化。k D曲線的形狀通常是pH的函數(shù)，并且通過(guò)添加鹽而變平。當(dāng)我看到這樣的扁平化時(shí)，我知道聚集是由疏水或偶極相互作用引起的。

在某些情況下，尺寸排阻色譜的結(jié)果和來(lái)自原始樣品的DLS的結(jié)果不一致。重要的是要將兩種測(cè)量結(jié)果都考慮在內(nèi)，以便對(duì)配方有一個(gè)很好的理解。

您如何使用此類信息評(píng)估配方?

一旦我們測(cè)量了各種輸出，我們就可以使用同源建模將它們與結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行比較。通過(guò)這種方式，我們可以找出表面變化的原因。如果我們發(fā)現(xiàn)k D對(duì)于不同的抗體以某種方式趨勢(shì)，我們可以評(píng)估這是否是由于疏水補(bǔ)丁引起的。

然而，我們的最終目標(biāo)是使用分子描述符來(lái)嘗試生成可用于預(yù)測(cè)特定蛋白質(zhì)結(jié)果的全局算法。我們的系統(tǒng)方法應(yīng)該有助于指出哪些是蛋白質(zhì)配方的關(guān)鍵生物物理特性和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的應(yīng)用。我們確實(shí)相信，我們的數(shù)據(jù)庫(kù)可以快速，節(jié)省成本地評(píng)估發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在篩選期間，使用DynaPro平板讀數(shù)器和SEC-MALS收集總數(shù)據(jù)點(diǎn)的75%，其中后者包括或連接到Wyatt miniDAWN MALS儀器和Wyatt Optilab差示折射計(jì)的HPLC裝置。因此，您可以看到光散射對(duì)蛋白質(zhì)配方開發(fā)的貢獻(xiàn)非常顯著。

您用于研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的新方法是什么?

我們使用DynaPro Plate Reader以新穎的方式研究單克隆抗體的物理穩(wěn)定性。

首先，將抗體在變性劑鹽酸胍中孵育，這允許我們使用等溫化學(xué)變性技術(shù)(ICD)通過(guò)內(nèi)在蛋白質(zhì)熒光跟蹤結(jié)構(gòu)的擾動(dòng)。然后，我們應(yīng)用了一種新方法，即'變性劑稀釋液(DFD)

通過(guò)隨后用緩沖液稀釋變性溶液，我們可以評(píng)估物理穩(wěn)定性的水平。如果物理穩(wěn)定性較低，最終解決方案將具有比較高的聚集體或更多聚集體。當(dāng)我們將DLS測(cè)量與SEC-MALS分析進(jìn)行比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)較高的流體動(dòng)力學(xué)半徑與更多的聚集體正相關(guān)。由于動(dòng)態(tài)光散射對(duì)聚集檢測(cè)非常敏感，并且(與SEC-MALS不同)是一種高通量技術(shù)，因此它為這種研究中的評(píng)估提供了理想的方法。

使用兩種不同的緩沖液 - 組氨酸和檸檬酸鹽 - 但相同的pH，由ICD評(píng)估的構(gòu)象穩(wěn)定性非常相似。然而，使用DFD我們能夠通過(guò)DLS和流體動(dòng)力學(xué)半徑區(qū)分最終穩(wěn)定性，這與膠體穩(wěn)定性有關(guān)。這個(gè)值就是我們只需要一個(gè)值，即流體動(dòng)力學(xué)半徑，就可以得到全貌。

從我們的觀點(diǎn)來(lái)看，在從不同濃度的變性劑稀釋后使用DynaPro Plate Reader跟蹤聚集是一種非常有前途的方法，用于探測(cè)蛋白質(zhì)在不同配方中的物理穩(wěn)定性。

DFD方法是等溫的，因此我們避免了樣品加熱引起的所有問題，例如，可能發(fā)生的緩沖液pH的變化。它只需要非常短的測(cè)量時(shí)間，因此具有很小的縮小和自動(dòng)化潛力。而且，它可以區(qū)分重疊的ICD曲線。這意味著您可以通過(guò)量化其膠體穩(wěn)定性而無(wú)需額外努力來(lái)區(qū)分具有相同構(gòu)象穩(wěn)定性的兩種制劑。

機(jī)器學(xué)習(xí)算法如何適應(yīng)?

機(jī)器學(xué)習(xí)算法是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在蛋白質(zhì)制劑開發(fā)中的應(yīng)用。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有處理藥物開發(fā)過(guò)程中經(jīng)常遇到的高度神經(jīng)線性問題的能力。

我們開發(fā)了一種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以提高我們對(duì)蛋白質(zhì)溶液行為的理解。我們將數(shù)據(jù)提供給算法，并預(yù)測(cè)結(jié)果。例如，如果我們輸入有關(guān)主要序列和配方的信息，我們將恢復(fù)聚合的溫度。

因此，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)代表了經(jīng)典統(tǒng)計(jì)方法的一個(gè)非常有趣的替代方案。當(dāng)應(yīng)用于高度非線性的數(shù)據(jù)集時(shí)，它可以相當(dāng)成功，并且這種數(shù)據(jù)集是制藥開發(fā)中最常遇到的。

它可以應(yīng)用于簡(jiǎn)單地基于氨基酸組成優(yōu)化生物制劑。這將允許選擇具有良好預(yù)測(cè)的T m，T agg，k D的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且在某些情況下單體保留，甚至在它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)之前。

使用各種模型，我們驗(yàn)證了算法，發(fā)現(xiàn)T agg的預(yù)測(cè)非常準(zhǔn)確。它還準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)k D是陽(yáng)性還是陰性(即，蛋白質(zhì)是自排斥的或自我吸引的，分別對(duì)應(yīng)于膠體穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性)。回歸問題很難解決，所以我們關(guān)注的是k D的符號(hào)而不是推導(dǎo)出一個(gè)定量值。

我們還對(duì)預(yù)測(cè)應(yīng)力后的單體保留或損失感興趣。單體保留的預(yù)測(cè)，即在應(yīng)力下不聚集或碎裂的材料的比例，也是相當(dāng)準(zhǔn)確的。

大量的背景噪音意味著很難區(qū)分不同的配方。但是，我們可以預(yù)測(cè)一種蛋白質(zhì)是否比另一種蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。由于這是從初級(jí)序列預(yù)測(cè)的，因此我們可以對(duì)候選生物制劑的穩(wěn)定性進(jìn)行相對(duì)可靠的估計(jì)，而無(wú)需對(duì)每種蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)和直接測(cè)量。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的主要缺點(diǎn)是可解釋性。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出不是描述實(shí)際的算法過(guò)程，而是對(duì)輸入算法的數(shù)據(jù)的解釋。它確實(shí)有助于我們繪制相關(guān)性，這可以為我們提供有關(guān)該過(guò)程的更多信息。

總之，高通量光散射是篩選和深入表征蛋白質(zhì)物理穩(wěn)定性的完美工具。一旦完成，PIPPI數(shù)據(jù)庫(kù)將有助于快速評(píng)估蛋白質(zhì)是否適合開發(fā)。同樣，機(jī)器學(xué)習(xí)算法將提供數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的預(yù)測(cè)，以通知這些決策，并在新蛋白療法的開發(fā)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)成本節(jié)約。