哈佛大學(xué)的研究人員更接近了解沙眼衣原體細(xì)菌如何利用宿主細(xì)胞的分子機(jī)制進(jìn)行入侵。該團(tuán)隊(duì)采用基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的CRISPR篩選來(lái)鑒定已知促進(jìn)致病性侵襲的三種主要候選基因。

專(zhuān)性細(xì)菌沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)是一種陰險(xiǎn)的微生物，可導(dǎo)致人類(lèi)性傳播疾病衣原體(Chlamydia)。

感染是進(jìn)行性的，未確診的患者失明，盆腔炎和不育的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，對(duì)支持沙眼衣原體發(fā)病機(jī)制的分子事件- 特別是人類(lèi)宿主特有的感染許可因子 -的發(fā)展理解為治療學(xué)的發(fā)展提供了新的途徑。

該研究以現(xiàn)有研究為基礎(chǔ)，通過(guò)在人類(lèi)細(xì)胞的全基因組篩選中使用一種遺傳工具RNAi，重點(diǎn)關(guān)注候選宿主因子的鑒定。這些篩選基于功能喪失，其中編碼因子的基因被減少或消除。

自那以后，CRISPR / Cas9編輯技術(shù)的出現(xiàn)為進(jìn)行全基因組功能喪失篩選提供了一種新的改進(jìn)方法。

結(jié)果出人意料

Park及其同事證實(shí)了之前的研究，該研究表明超過(guò)50%的候選基因是與硫酸乙酰肝素合成有關(guān)的基因，證明硫酸乙酰肝素在沙眼衣原體附著于宿主細(xì)胞中的作用。

該小組進(jìn)一步描述了一位未經(jīng)懷疑的候選人的角色;COPI - 一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，如下所述。以前的研究未能證明COPI在發(fā)病機(jī)制中的作用。

來(lái)自哈佛大學(xué)Waldor實(shí)驗(yàn)室的研究小組使用基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的人類(lèi)細(xì)胞的CRISPR篩選來(lái)鑒定能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)沙眼衣原體入侵過(guò)程的宿主蛋白。

該團(tuán)隊(duì)用表達(dá)熒光標(biāo)記的沙眼衣原體感染Cas9細(xì)胞的功能喪失庫(kù)。選擇熒光標(biāo)記陰性的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)菌侵入細(xì)胞，遮蔽熒光。

推測(cè)這些細(xì)胞富集候選基因，因?yàn)槿肭质怯伤拗饕蜃咏閷?dǎo)的。對(duì)這些細(xì)胞的sgRNA進(jìn)行測(cè)序并分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，產(chǎn)生17種可能的候選基因。

負(fù)責(zé)這些因素的主要基因分為三大類(lèi)：

細(xì)胞表面糖胺聚糖硫酸乙酰肝素的生物合成酶。硫酸乙酰肝素作為分子手柄，作為病原體的受體。

肌動(dòng)蛋白重塑的誘導(dǎo)劑，促進(jìn)沙眼衣原體入侵。

外殼蛋白復(fù)合物I(COPI)，其有助于硫酸乙酰肝素生物合成和細(xì)胞表面呈遞，沙眼衣原體的附著和其III型分泌系統(tǒng)(T3SS)的易位 - 能夠?qū)⑿?yīng)蛋白注射到宿主細(xì)胞中的裝置。

COPI的鑒定值得注意;研究人員假設(shè)，先前研究中采用的方法可以防止罕見(jiàn)的亞型(那些具有導(dǎo)致部分基因功能喪失的突變)的COPI等位基因被鑒定出來(lái)。CRISPR的使用規(guī)避了這一點(diǎn)，提供了富集COPI等位基因的方法。

研究人員假設(shè)COPI介導(dǎo)的HS的合成和/或表面呈遞通過(guò)間接機(jī)制發(fā)生，所述間接機(jī)制起作用以改變細(xì)胞的高爾基體和囊泡動(dòng)力學(xué)。因此，推測(cè)HS依賴(lài)性病原體對(duì)COPI的侵襲具有共同依賴(lài)性。HS，雖然最高得分候選基因?qū)τ谏逞垡略w感染不是必需的，表明也存在獨(dú)立于該蛋白多糖的途徑。

該研究還證明了COPI在宿主細(xì)胞附著下游的作用。當(dāng)研究人員使用急性破壞COPI的golgicide A時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)TarP(一種通過(guò)肌動(dòng)蛋白捆綁活動(dòng)刺激沙眼衣原體T3SS的效應(yīng)蛋白)的轉(zhuǎn)運(yùn)減少了。Park等。假設(shè)T3SS中的這種缺陷起因于膜脂組成的改變，這限制了其功能。

基于FACS的CRISPR篩查是一種有用的工具嗎?

研究人員得出結(jié)論，COPI在沙眼衣原體侵襲位置COPI作為一種有問(wèn)題的治療候選基因的背景下引發(fā)多重作用或其多效性的能力。這是因?yàn)殡y以確定與病原體入侵過(guò)程中的步驟的具體聯(lián)系。因此，作者預(yù)測(cè)需要新的蛋白質(zhì)擾動(dòng)策略，以促進(jìn)理解所有基因在病原體感染中的作用。

盡管如此，作者已經(jīng)成功地證明了基于FACS的CRISPR篩選在鑒定導(dǎo)致致病性入侵的宿主因子的身份和機(jī)制作用方面的效用。用Park等人的話(huà)來(lái)說(shuō)。“我們的研究結(jié)果再次證明了利用細(xì)胞內(nèi)病原體作為探針來(lái)闡明宿主細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)用性”。