西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的一個(gè)研究小組開發(fā)了一系列新型熒光輔助細(xì)胞分選(FACS)方案，可以分離神經(jīng)祖細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞和來自病毒感染大腦類器官的神經(jīng)元，用于下游多組學(xué)分析。

這項(xiàng)工作為開發(fā)從復(fù)雜的體外器官模型中返回有意義數(shù)據(jù)的分析的挑戰(zhàn)提供了解決方案，因?yàn)閺漠愘|(zhì)系統(tǒng)中分選同源細(xì)胞群的能力是分析開發(fā)的基礎(chǔ)。該團(tuán)隊(duì)通過證明分離的細(xì)胞群對下游表觀遺傳和基因表達(dá)分析的適應(yīng)性，驗(yàn)證了其技術(shù)的可譯性。

使用體外培養(yǎng)的簡化微型器官，稱為類器官，為研究人類疾病和器官發(fā)育提供了一個(gè)極好的模型系統(tǒng)。類器官的三維性質(zhì)提供了最接近的體內(nèi)條件模擬，因此，研究人員可以探索器官發(fā)育和模擬復(fù)雜的人類疾病。

腦發(fā)育和疾病是發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的新興線索，因此腦類器官是重點(diǎn)的器官系統(tǒng)。腦類器官還使研究人員能夠確定病毒感染對大腦發(fā)育的影響。

值得注意的是寨卡病毒，特別是因?yàn)楫a(chǎn)前寨卡病毒感染與先天性小頭畸形之間存在因果關(guān)系。直到最近，在病毒感染或治療研究中使用類器官一直受限于它們對下游多組學(xué)分析的不良適應(yīng)性 - 特別是因?yàn)榻M成器官的異質(zhì)細(xì)胞群眾所周知地難以分離。

三個(gè)協(xié)議，一個(gè)目標(biāo)

在Sylvie Janssens教授的帶領(lǐng)下，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了三種方案，用于基于FACS的病毒感染腦類器官特異性神經(jīng)細(xì)胞群的鑒定和分離。

第一個(gè)描述了二維(2D)培養(yǎng)物的產(chǎn)生，該培養(yǎng)物針對病毒感染進(jìn)行了高度優(yōu)化。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究小組在12周內(nèi)在基質(zhì)膠上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(hESCs)，并收集并解離所得的腦類器官。將它們鋪板并留下以建立細(xì)胞相互作用以產(chǎn)生2D大腦器官培養(yǎng)物。為了測試病毒感染的成功，寨卡病毒感染腦類器官是視覺的

由Janssens等人開發(fā)的第二個(gè)協(xié)議。概述了寨卡病毒原種的制備，腦器官培養(yǎng)物的感染及其隨后的FACS準(zhǔn)備。培養(yǎng)病毒原種，通過噬斑測定確定最佳病毒滴度(用于感染的病毒噬斑形成單位(pfu))所需的適當(dāng)系列稀釋。

隨后使用適量的病毒感染大腦器官培養(yǎng)物;感染后將細(xì)胞放置72小時(shí)。為了制備用于FACS的細(xì)胞，該團(tuán)隊(duì)對通過熒光團(tuán)綴合的抗體進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫染色。為了確定病毒感染的成功，還用針對ZIKV的熒光團(tuán)綴合的抗體染色細(xì)胞。

在他們的最終方案中，該團(tuán)隊(duì)概述了如何通過熒光標(biāo)記推斷如何設(shè)置用于通過細(xì)胞類型優(yōu)化分離腦類器官衍生細(xì)胞的參數(shù)和門。他們的協(xié)議包括六色細(xì)胞分選方法，用于細(xì)胞的精確功能表征。這包括確定生成前向和側(cè)向散射所需的最佳設(shè)置。

在優(yōu)化FACS操作后，Janssens及其同事概述了細(xì)胞分選方法;首先，基于熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體結(jié)合寨卡病毒對感染細(xì)胞進(jìn)行分選，然后應(yīng)用門控方案分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元。然后處理細(xì)胞用于下游應(yīng)用 - 特別是在多組學(xué)分析中。

擴(kuò)大下游分析的潛力

該小組證明了該議定書的普遍性;單循環(huán)HIV慢病毒報(bào)告病毒的使用舉例說明了該方案的擴(kuò)展，以包括能夠進(jìn)行人神經(jīng)細(xì)胞感染的其他病毒。

將表達(dá)GFP報(bào)告基因的該單循環(huán)慢病毒載體與水泡性口炎病毒(VSV-G)包膜糖蛋白組合以產(chǎn)生病毒假型。然后該團(tuán)隊(duì)用慢病毒報(bào)告病毒感染器官培養(yǎng)物，并使用流式細(xì)胞儀設(shè)置和第二個(gè)方案中概述的門控策略對細(xì)胞進(jìn)行分選。

Janssens及其同事預(yù)測，他們的基于FACS的方案將能夠?qū)?fù)雜的多細(xì)胞類器官中定義的細(xì)胞類型進(jìn)行全面分析，從而提供了體內(nèi)環(huán)境的精確再現(xiàn)。

基于顯微鏡的FACS基于細(xì)胞鑒定不僅減少了輸出量化誤差，而且擴(kuò)大了對已識(shí)別細(xì)胞的下游分析的選擇。“

Sylvie Janssens，首席研究員

致謝

這項(xiàng)工作得到了赫芬頓基金會(huì)(TPZ)，NIH撥款(NIH / NIAID U19AI118610和R21AI129486到AG-S和R21 AI125236到VS)以及比利時(shí)美國教育基金會(huì)(SJ和MS的獎(jiǎng)學(xué)金)的支持。作者聲明沒有競爭性的經(jīng)濟(jì)利益。