在許多層面上，CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)難以控制。一段時(shí)間以來(lái)，科學(xué)家已經(jīng)知道細(xì)菌已經(jīng)開發(fā)出一種方法 - “抗CRISPR”系統(tǒng) - 來(lái)干擾細(xì)胞中的Cas核酸酶功能。現(xiàn)在，Broad研究所開發(fā)的高通量檢測(cè)方法已經(jīng)確定了第一個(gè)小分子“抗CRISPR”，這項(xiàng)工作不僅可以更精確地控制基因組編輯技術(shù)，而且可以為進(jìn)一步研究這些分子奠定基礎(chǔ)。

這項(xiàng)名為“鑒定CRISPR-Cas9的小分子抑制劑的高通量平臺(tái)”的論文中描述的這項(xiàng)研究發(fā)表在Cell雜志上。

“這些研究為快速鑒定和使用針對(duì)SpCas9和下一代CRISPR相關(guān)核酸酶的小分子抑制劑奠定了基礎(chǔ)，”Broad研究所的Amit Choudhary博士說(shuō)。“靶向CRISPR相關(guān)核酸酶的小分子抑制劑具有廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)，生物醫(yī)學(xué)和國(guó)防研究以及生物技術(shù)應(yīng)用的潛力。”

Choudhary及其同事篩選了多種小分子，以鑒定化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)的小分子抑制劑。為此，他們開發(fā)了高通量初級(jí)和二級(jí)檢測(cè)SpCas9-DNA結(jié)合和SpCas9 DNA切割活性，分別。對(duì)于初步測(cè)定，他們使用熒光偏振來(lái)監(jiān)測(cè)SpCas9和含有PAM序列的熒光團(tuán)標(biāo)記的DNA區(qū)段之間的相互作用。在二級(jí)測(cè)定中，他們使用自動(dòng)顯微鏡來(lái)測(cè)量由SpCas9介導(dǎo)的細(xì)胞中報(bào)告基因的DNA切割誘導(dǎo)的熒光變化。

使用這些分析，該團(tuán)隊(duì)確定了兩種先導(dǎo)化合物，這些化合物破壞了SpCas9在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以劑量依賴性方式結(jié)合DNA并抑制SpCas9介導(dǎo)的DNA裂解的能力。由于它們通過(guò)酶阻斷DNA結(jié)合，因此這些分子還抑制SpCas9的催化受損技術(shù)，包括用于轉(zhuǎn)錄激活的技術(shù)，并且在人血漿中是穩(wěn)定的。

小分子容易進(jìn)入細(xì)胞并且比先前發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白小得多。它們重量<500 Da，具有細(xì)胞滲透性，并允許基于SpCas9技術(shù)的可逆和劑量依賴性控制，包括其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編輯，堿基編輯和表觀遺傳編輯的應(yīng)用。

盡管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但它們很大并且對(duì)細(xì)胞不可滲透，在行動(dòng)中不可逆轉(zhuǎn)，可被蛋白酶咀嚼，并且可能在體內(nèi)造成不良免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。相反，小分子抑制劑是蛋白水解穩(wěn)定的，可逆的，并且通常是非免疫原性的，并且可以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散容易地遞送至細(xì)胞。此外，它們可以低成本大規(guī)模合成，幾批間差異很小。

目前，SpCas9正在開發(fā)作為多種疾病的基因治療劑，包括HIV，視力障礙，肌肉萎縮癥和其他遺傳性疾病。但是，這些治療應(yīng)用將極大地受益于對(duì)SpCas9活性的劑量和時(shí)間的精確控制以減少脫靶效應(yīng)?？刂芐pCas9活動(dòng)的這些方面也可以使其他應(yīng)用受益，例如有效編輯模型生物的DNA以模擬和研究疾病，以及基因驅(qū)動(dòng)在基因工程蚊子工程蚊子中的使用，以遏制瘧疾和其他蚊子傳播疾病。

“這些結(jié)果為CRISPR-Cas9活動(dòng)的精確化學(xué)控制奠定了基礎(chǔ)，使得能夠安全使用這些技術(shù)，”Choudhary說(shuō)。“然而，這些分子還沒(méi)有為人類應(yīng)用做好準(zhǔn)備，也沒(méi)有在生物體內(nèi)進(jìn)行功效測(cè)試。”

在未來(lái)的研究中，研究人員計(jì)劃在SpCas9：gRNA復(fù)合物上鑒定抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，檢查其作用機(jī)制，并優(yōu)化其效力。他們還將確定分子是否與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的其他靶標(biāo)相互作用，并評(píng)估它們對(duì)其他CRISPR相關(guān)核酸酶的特異性。細(xì)胞論文中包含的早期結(jié)果表明，這些分子對(duì)其靶標(biāo)非常特異，因?yàn)樗鼈儗?duì)遠(yuǎn)緣相關(guān)的CRISPR酶Cas12a沒(méi)有影響。