CRISPR-Cas9基因編輯基于為保護自身免受病毒侵害而開發(fā)的策略細菌?，F(xiàn)在的研究表明，對抗病毒產生的抗抑制蛋白被稱為抗CRISPRs，可用于改進CRISPR-Cas9作為基因治療工具，減少可能引起不良副作用的脫靶基因編輯。本周在“ 科學進展 ”雜志網絡版上發(fā)表的一項研究顯示，加州大學伯克利分校和加州大學舊金山分校的研究人員表示，最近發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白質可以將脫靶效應降低四倍，就像殺死開關一樣禁用CRISPR-Cas9完成其工作后。

該研究表明，一種名為AcrIIA4的特異性抗CRISPR蛋白質降低了CRISPR-Cas9分子的脫靶效應的四倍，該分子使用指導RNA來發(fā)現(xiàn)，剪切和替換導致鐮狀細胞病的突變血紅蛋白基因。它沒有顯著減少所需的目標基因編輯。

“由于脫靶基因編輯，可能會出現(xiàn)意想不到的突變，但我們的論文與許多其他人一樣 - 表明脫靶效應可以調節(jié)，并且沒有人們想象的那么嚴重，”加州大學伯克利分校博士后研究員Jiyung說。 Jenny Shin，來自創(chuàng)新基因組學研究所的Jacob Corn實驗室，也是該論文的三位第一作者之一。

在她對培養(yǎng)的人體細胞的實驗中，Shin發(fā)現(xiàn)交付CRISPR-Cas9然后幾小時后，抗??CRISPR蛋白，是減少脫靶效應的最有效方法。這種蛋白質模仿DNA，在Cas9上閃爍，這種酶實際上切割了雙鏈DNA，并阻止了進一步的切割。

“即使經過六個小時的有效CRISPR，插入抗CRISPR也會使靶外效應降低兩倍以上，與目標效應相比，”Shin說。“治療上，你可以先用CRISPR治療患者，然后再用抗CRISPR治療，減少脫靶效應。”

發(fā)現(xiàn)AcrIIA4的研究員，加州大學舊金山分校的Joseph Bondy-Denomy預測這些抗CRISPR蛋白質成為CRISPR基因治療的標準部分，與CRISPR-Cas9一起在一段固定的時間后禁用基因編輯以防止隨機關閉 - 切割目標。“這種Cas9抑制劑可以編碼在與Cas9相同的DNA上，例如，在基因編輯完成后精確定時關閉Cas9，而不是讓Cas9在細胞中停留并冒著脫靶效應，”Bondy說。 -Denomy，也是該論文的共同作者。

抗CRISPR結合

該團隊包括在CRISPR-Cas9基因編輯的發(fā)明者之一Jennifer Doudna實驗室的研究人員，他們確定了抗CRISPR蛋白如何與CRISPR-Cas9復合物結合。使用低溫電子顯微鏡，他們發(fā)現(xiàn)抗CRISPR基本上模仿DNA，誘使CRISPR-Cas9與其結合，然后永不放棄。

CRISPR抑制劑靶向Cas9蛋白上的一個斑點，這對Cas9的功能至關重要，當它被抗CRISPR結合時，它不能用于切割DNA。

去年，Bondy-Denomy報道發(fā)現(xiàn)四種抗CRISPR蛋白被攻擊病毒用于滅活細菌單核細胞增生李斯特氏菌中發(fā)現(xiàn)的Cas9蛋白的版本。其中兩種也抑制了研究人員最常使用的Cas9蛋白，后者改編自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)細菌，被稱為SpyCas9。另一個研究小組發(fā)現(xiàn)了另外三種抗CRISPR蛋白，這些蛋白可以對抗一種不同但有前途的Cas9 蛋白，該蛋白適用于腦膜炎奈瑟氏球菌。

目前的研究觀察了李斯特菌中的一種蛋白質AcrIIA4對載有引導RNA的SpyCas9的影響，該引導RNA在互補DNA上結合并結合并切割。

加州大學伯克利分校和其他地方的研究表明，CRISPR-Cas9不斷對細胞的DNA修復系統(tǒng)進行研究：當酶切割其靶位點時，細胞修復DNA，CRISPR-Cas9再次切割，重復這種惡性循環(huán)直至出現(xiàn)突變在防止酶結合的DNA中，此時CRISPR-Cas9分子繼續(xù)移動以找到另一個結合位點。

目前來自Corn和Doudna實驗室的工作表明，在Cas9成功編輯靶基因后添加抗CRISPR可以防止對基因組其他部分的意外損害。

“將Cas9基因編輯關閉的能力與開啟它的能力同樣重要，”IGI生物醫(yī)學科學主任，加州大學伯克利分校和分子與細胞生物學輔助教授兼玉說。“想象一下，如果你的電動剃須刀沒有關閉開關!對于最終的治療應用，能夠精確控制基因編輯活動的時間和地點至關重要?？笴RISPR蛋白質提供了完全關閉Cas9的機會。微調它的活動。“

“Jenny的數(shù)據(jù)顯示，有一個理想的時間窗口讓Cas9完成它的工作，然后在經過這段時間之后將其關閉，”Bondy-Denomy說。“我們實際上可以使用抗CRISPR蛋白質作為工具來確定那個時間窗口是什么，也就是說，對于任何一種具有任何一種指導RNA序列的細胞類型，我們希望Cas9在細胞中活躍多久。”