將陽光轉(zhuǎn)化為能量的能力是自然界最杰出的成就之一。科學(xué)家們了解光合作用的基本過程，但許多關(guān)鍵細(xì)節(jié)仍然難以捉摸，發(fā)生在長期被認(rèn)為太小而無法探測的尺度和短暫的時(shí)間尺度上。

在一項(xiàng)由Petra Fromme和Nadia Zatsepin在應(yīng)用設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)生物設(shè)計(jì)中心，分子科學(xué)學(xué)院和ASU物理系領(lǐng)導(dǎo)的新研究中，研究人員用超短X射線脈沖研究了光系統(tǒng)I(PSI)的結(jié)構(gòu)。位于德國漢堡的歐洲X射線自由電子激光(EuXFEL)。

PSI是一個(gè)大型生物分子系統(tǒng)，可充當(dāng)太陽能轉(zhuǎn)換器，將太陽能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能。光合作用為地球上所有復(fù)雜的生命提供能量，并提供我們呼吸的氧氣。揭示光合作用秘密的進(jìn)展有望改善農(nóng)業(yè)狀況，并有助于發(fā)展將自然效率與人類工程系統(tǒng)的穩(wěn)定性相結(jié)合的下一代太陽能存儲(chǔ)系統(tǒng)。

“這項(xiàng)工作是如此重要，因?yàn)樗@示了兆赫茲級連續(xù)結(jié)晶學(xué)概念的第一個(gè)證明，它具有光合作用中最大，最復(fù)雜的膜蛋白之一：光系統(tǒng)I” Fromme說。“這項(xiàng)工作為在EuXFEL上進(jìn)行時(shí)間分辨研究鋪平了道路，以確定光合作用中電子的光驅(qū)動(dòng)路徑的分子電影，或可視化癌癥藥物如何攻擊有故障的蛋白質(zhì)。”

最近開始運(yùn)行的EuXFEL是第一個(gè)使用超導(dǎo)線性加速器的人，它產(chǎn)生了令人興奮的新功能，包括其X射線脈沖的非常高的兆赫茲重復(fù)率-比任何其他XFEL快9000倍-脈沖間隔小于1百萬分之一秒。借助這些令人難以置信的短暫X射線爆發(fā)，研究人員將能夠更快地記錄基本生物學(xué)過程的分子電影，并可能影響醫(yī)學(xué)，藥理學(xué)，化學(xué)，物理，材料科學(xué)，能源研究，環(huán)境研究，電子，納米技術(shù)和光子學(xué)。佩特拉·弗洛姆(Petra Fromme)和娜迪亞·扎瑟平(Nadia Zatsepin)是該論文的共同通訊作者，已發(fā)表在本期《自然通訊》上。

人數(shù)優(yōu)勢

Fromme是應(yīng)用結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)生物設(shè)計(jì)中心(CASD)的主任，領(lǐng)導(dǎo)該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)的工作，而Zatsepin領(lǐng)導(dǎo)XFEL數(shù)據(jù)分析團(tuán)隊(duì)。

ASU系前研究助理教授Zatsepin強(qiáng)調(diào)：“這是連續(xù)飛秒晶體學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要里程碑，它建立在龐大的跨學(xué)科國際團(tuán)隊(duì)的協(xié)調(diào)配合下，并且在不同領(lǐng)域的多年發(fā)展中。” CASD物理與生物設(shè)計(jì)專業(yè)的博士學(xué)位，現(xiàn)在是澳大利亞拉籌伯大學(xué)的高級研究員。

該論文的共同第一作者克里斯托弗·吉斯里爾(Christopher Gisriel)在Fromme實(shí)驗(yàn)室擔(dān)任博士后研究員期間對該項(xiàng)目進(jìn)行了研究，對此項(xiàng)目感到很興奮。“系列飛秒晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)中的快速數(shù)據(jù)收集使那些對酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系感興趣的人更容易使用這項(xiàng)革命性技術(shù)。我們在《自然通訊》上的新出版物對此進(jìn)行了例證，該出版物表明，即使最困難和最復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也可以解決。通過連續(xù)的飛秒晶體學(xué)，同時(shí)以兆赫的重復(fù)頻率收集數(shù)據(jù)。”

“很高興看到許多人的辛勤工作推動(dòng)了該項(xiàng)目的實(shí)現(xiàn)，”去年畢業(yè)并獲得博士學(xué)位的共同第一作者杰西·科(Jesse Coe)說。亞利桑那州立大學(xué)生物化學(xué)專業(yè)。“這是朝正確方向邁出的重要一步，有助于更好地了解自然界數(shù)十億年來不斷完善的電子轉(zhuǎn)移過程。”

佩特拉·弗洛姆(Petra Fromme)是應(yīng)用結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)生物設(shè)計(jì)中心(CASD)的主任，并領(lǐng)導(dǎo)該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)的工作。圖片來源：ASU生物設(shè)計(jì)研究所

極限科學(xué)

XFEL(用于X射線自由電子激光器)發(fā)出的X射線光比常規(guī)X射線源的亮度高十億倍。電子被加速至接近光速，并通過一系列交替的磁體(稱為波蕩器)之間的間隙饋送，產(chǎn)生了類似激光的明亮X射線脈沖。起伏器迫使電子擺動(dòng)并聚集成離散的包裝。每個(gè)完全同步的擺動(dòng)電子束沿電子飛行路徑發(fā)射一個(gè)強(qiáng)大的簡短X射線脈沖。

在連續(xù)飛秒晶體學(xué)中，蛋白質(zhì)晶體的射流在室溫下被注入到脈沖XFEL光束的路徑中，以衍射圖的形式產(chǎn)生結(jié)構(gòu)信息。通過這些模式，科學(xué)家可以確定接近自然條件下蛋白質(zhì)的原子級圖像，從而為工作中的分子精確分子化鋪平了道路。

X射線會(huì)破壞生物分子，這個(gè)問題困擾了數(shù)十年的結(jié)構(gòu)確定工作，需要凍結(jié)生物分子以限制破壞。但是XFEL產(chǎn)生的X射線爆發(fā)非常短(僅飛秒)，以至于在發(fā)生破壞之前就可以記錄分子的X射線散射，就像使用快速相機(jī)快門一樣。作為參考，飛秒是十億分之一秒的百萬分之一，而與之相同的比率是3200萬年。

由于XFEL設(shè)施的復(fù)雜性，規(guī)模和成本，目前在全球范圍內(nèi)只有5個(gè)可用于此類實(shí)驗(yàn)，這對于研究人員來說是一個(gè)嚴(yán)重的瓶頸，因?yàn)槊總€(gè)XFEL通常一次只能容納一個(gè)實(shí)驗(yàn)。大多數(shù)XFEL每秒產(chǎn)生30至120次X射線脈沖，收集確定單一結(jié)構(gòu)所需的數(shù)據(jù)可能要花費(fèi)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，更不用說分子電影中的一系列幀了。EuXFEL是第一個(gè)在其設(shè)計(jì)中采用超導(dǎo)線性加速器的設(shè)備，可實(shí)現(xiàn)任何XFEL最快的X射線脈沖序列，從而可以顯著減少確定電影的每個(gè)結(jié)構(gòu)或幀所需的時(shí)間。

高風(fēng)險(xiǎn)，高回報(bào)

由于樣品被強(qiáng)力的X射線脈沖所掩蓋，因此必須及時(shí)補(bǔ)充下一個(gè)X射線脈沖，這要求在EuXFEL上，PSI晶體的輸送速度比早期XFEL快9000倍，而噴射速度為大約每秒50米(每秒160英尺)，就像一條微流體消防水帶。這具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗枰鶆蚓w中包含的大量珍貴蛋白質(zhì)才能達(dá)到這些高噴射速度，并避免阻塞樣品傳輸系統(tǒng)。大的膜蛋白很難分離，結(jié)晶并傳遞到光束上，以至于能否在EuXFEL上研究這種重要的蛋白類型尚不清楚。

研究小組開發(fā)了新的方法，使PSI可以由36種蛋白質(zhì)和381個(gè)輔助因子組成，是一個(gè)大分子復(fù)合物，其中包括288個(gè)葉綠素(吸收光的綠色色素)，具有超過150,000個(gè)原子，并且比以前研究的蛋白質(zhì)大20倍以上在EuXFEL上，其結(jié)構(gòu)在室溫下達(dá)到了2.9埃的分辨率，這是一個(gè)重要的里程碑。

為了進(jìn)行這項(xiàng)新研究，必須生長數(shù)十億個(gè)源自藍(lán)細(xì)菌的PSI膜蛋白微晶。需要從納米晶種快速生長晶體，以確保晶體尺寸和形狀的基本均勻性。PSI是一種膜蛋白，是一類非常重要的蛋白，很難表征。它們的精細(xì)結(jié)構(gòu)嵌入在細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中。通常，必須將它們以完全活性的形式從其天然環(huán)境中小心地分離出來，并轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶態(tài)，在這種狀態(tài)下分子堆積成晶體，但保持其所有天然功能。

對于PSI，這可以通過用非常溫和的去污劑進(jìn)行提取來實(shí)現(xiàn)，該去污劑可以代替膜并像水池內(nèi)管一樣圍繞蛋白質(zhì)，從而模仿天然膜環(huán)境，并在將PSI填充到晶體中后使其保持完全功能。因此，當(dāng)研究人員將光照射到PSI天線系統(tǒng)捕獲綠色光的綠色顏料(葉綠素)上時(shí)，就會(huì)利用該能量將電子發(fā)射到整個(gè)膜上。

納迪亞·扎特謝平(Nadia Zatsepin)，曾任美國亞利桑那州立大學(xué)物理學(xué)與生物設(shè)計(jì)系CASD系研究助理教授，現(xiàn)任澳大利亞拉籌伯大學(xué)高級研究員。圖片來源：ASU生物設(shè)計(jì)研究所

為了使PSI充分發(fā)揮功能，僅將晶體包裝不牢固，其中包含78%的水，這使它們像在陽光下的黃油一樣柔軟，并且難以處理這些易碎的晶體。“要分離，表征和結(jié)晶一克PSI或十億億個(gè)PSI分子，以其完全活性的形式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這是我團(tuán)隊(duì)中的學(xué)生和研究人員的巨大努力”，F(xiàn)romme說。更高的重復(fù)率和新穎的樣品輸送系統(tǒng)，將大大減少樣品消耗。”

衍射數(shù)據(jù)的記錄和分析是另一個(gè)挑戰(zhàn)。EuXFEL和DESY開發(fā)了一種獨(dú)特的X射線檢測器，用于處理EuXFEL進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的需求：自適應(yīng)增益積分像素檢測器或AGIPD。AGIPD的100萬個(gè)像素中的每個(gè)像素的寬度不到百分之一英寸，并包含352個(gè)模擬存儲(chǔ)單元，這使AGIPD可以在較大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)以兆赫茲速率收集數(shù)據(jù)。但是，要從大膜蛋白的微晶收集準(zhǔn)確的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，需要在空間分辨率和數(shù)據(jù)采樣之間進(jìn)行折衷。

Zatsepin警告說：“由于用X射線探測器像素?zé)o法充分解決衍射點(diǎn)，因此以當(dāng)前的探測器尺寸推動(dòng)更高分辨率的數(shù)據(jù)采集可能會(huì)排除對晶體學(xué)數(shù)據(jù)的有用處理”，Zatsepin警告說，“然而，在數(shù)據(jù)速率和動(dòng)態(tài)范圍方面， AGIPD的能力令人難以置信。”

自第一個(gè)高分辨率XFEL以來，由CFEL，DESY和ASU的合作者牽頭開發(fā)的，專門為應(yīng)對XFEL晶體學(xué)中海量數(shù)據(jù)集所特有的挑戰(zhàn)而專門設(shè)計(jì)的新型數(shù)據(jù)縮減和晶體學(xué)分析軟件，已經(jīng)走了很長一段路在2011年進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Zatsepin補(bǔ)充說：“我們的軟件和DESY的高性能計(jì)算功能實(shí)際上已經(jīng)通過EuXFEL產(chǎn)生的空前數(shù)據(jù)量進(jìn)行了測試。突破尖端技術(shù)的極限總是令人興奮。”

膜蛋白：松軟，但強(qiáng)大

諸如PSI之類的膜蛋白之所以被命名，是因?yàn)樗鼈兦度爰?xì)胞膜中，對包括呼吸，神經(jīng)功能，營養(yǎng)吸收和細(xì)胞信號傳導(dǎo)在內(nèi)的所有生命過程都至關(guān)重要。由于它們位于每個(gè)細(xì)胞的表面，因此它們也是最重要的藥物靶標(biāo)。當(dāng)前所有藥物中有60%以上是針對膜蛋白的。因此，設(shè)計(jì)具有更少副作用的更有效藥物取決于了解特定藥物如何與其靶蛋白結(jié)合以及其高度詳細(xì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象和動(dòng)態(tài)活性。

盡管它們在生物學(xué)中具有極其重要的意義，但膜蛋白結(jié)構(gòu)在迄今解決的所有蛋白結(jié)構(gòu)中所占比例不到1%，因?yàn)楸娝苤?，它們很難分離，表征和結(jié)晶。這就是結(jié)晶學(xué)方法的重大進(jìn)展，例如膜蛋白兆赫系列飛秒晶體學(xué)的出現(xiàn)，無疑會(huì)對科學(xué)界產(chǎn)生重大影響的原因。

需要一個(gè)村莊

沒有來自ASU，歐洲XFEL，DESY，超快X射線科學(xué)中心，Hauptman-Woodward研究所，SUNY Buffalo，SLAC等15個(gè)機(jī)構(gòu)的近80名研究人員的不懈努力，這些最新成就將是不可能的。 ，漢堡大學(xué)，哥廷根大學(xué)，匈牙利科學(xué)院，田納西大學(xué)，勞倫斯·利弗莫爾國家實(shí)驗(yàn)室，南安普敦大學(xué)，漢堡工業(yè)大學(xué)，威斯康星大學(xué)。該研究小組包括美國國家科學(xué)基金會(huì)(NSF)BioXFEL科學(xué)技術(shù)中心的合作者，以及國際合作者，包括EuXFEL光束線的首席科學(xué)家Adrian P. Mancuso和Romain Letrun，以及CFEL / DESY的Oleksandr Yefanov和Anton Barty，他們與ASU團(tuán)隊(duì)進(jìn)行復(fù)雜數(shù)據(jù)分析。