對于Cas9在研究和治療方面的所有潛力，它以及CRISPR相關(guān)家族中的其他酶具有局限性。為了識(shí)別并結(jié)合DNA序列，Cas9需要特定的一段基礎(chǔ)字母來伴隨目標(biāo)。該要求使得酶的大部分基因組不可接近，顯著降低了其應(yīng)用范圍。

但麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)布魯?shù)卵芯克?，哈佛大學(xué)和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所(HHMI)的一組研究人員已經(jīng)開發(fā)出新的Cas9變體，它們與更廣泛的所需基地兼容，可以進(jìn)入更多地區(qū)?；蚪M。更重要的是，這些新版本的蛋白質(zhì)比以前的版本更準(zhǔn)確地編輯它們的目標(biāo)。

該研究結(jié)果在本周的描述自然。

“我們通過擴(kuò)大Cas9的兼容性部分解除了序列限制，因此它可以'看到'更多的基因組，”資深作者David Mer，Merkin醫(yī)療保健變革技術(shù)研究所所長Richard Merkin教授和核心研究所說。廣泛研究所成員，哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教授，HHMI研究員。“為臨床和研究應(yīng)用開發(fā)CRISPR技術(shù)有很多努力，我們希望這項(xiàng)工作增加了特定感興趣的網(wǎng)站可以訪問的可能性。”

Cas9傳統(tǒng)上需要的堿基序列稱為PAM，用于“原型間隔相鄰基序”。最終，如果基因組中感興趣的位點(diǎn)附近不存在PAM，則天然CRISPR酶無法獲得它。即使是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最通用的Cas9酶，來自化膿性鏈球菌的SpCas9也無法獲得近95%的基因組用于其任何應(yīng)用(包括打開或關(guān)閉基因，DNA切割或堿基編輯)。這包括已知與人類疾病相關(guān)的大約四分之三的單堿基突變。

“即使對于SpCas9，PAM的要求也會(huì)對CRISPR的使用造成嚴(yán)重的瓶頸，”劉說。“如果您正在嘗試一種需要非常精確定位蛋白質(zhì)的CRISPR應(yīng)用程序，那么您需要幸運(yùn)的是在正確的位置安裝PAM。”

為了創(chuàng)建具有更多PAM選項(xiàng)的SpCas9變體，該團(tuán)隊(duì)使用了一種稱為噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化(PACE)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)于2011年在哈佛的劉實(shí)驗(yàn)室開發(fā)。在工程化噬菌體和細(xì)菌的生態(tài)系統(tǒng)中，PACE應(yīng)用進(jìn)化壓力來鼓勵(lì)噬菌體產(chǎn)生具有所需性狀的蛋白質(zhì)。

在這種情況下，噬菌體將Cas9基因攜帶到細(xì)菌中，細(xì)菌依次復(fù)制并突變Cas9 DNA。以前的研究已經(jīng)修改了Cas9的特定部分(通常是已知接觸DNA或指導(dǎo)RNA的部分蛋白質(zhì))，但PACE是獨(dú)特且無偏的，因?yàn)樗试S突變發(fā)生在整個(gè)基因上。

該系統(tǒng)經(jīng)過工程改造，只有Cas9基因獲得了能夠結(jié)合其他PAM的突變時(shí)，噬菌體才能復(fù)制。一旦它發(fā)生，噬菌體可以將該基因的版本傳遞給新一代 - 這將感染更多細(xì)菌并重復(fù)循環(huán)。PACE的工作速度比其他蛋白質(zhì)進(jìn)化方法快100多倍，在進(jìn)化過程中只需極少的人力。

PACE發(fā)現(xiàn)了許多形式的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的Cas9，或“xCas9”，但最優(yōu)的一種可以開啟基因組大約四分之一的位點(diǎn)，包括與人類疾病相關(guān)的近75%的點(diǎn)突變。Liu和他的同事在各種應(yīng)用中展示了xCas9，包括打開基因，切割DNA和編輯單堿基對(C•G到T•A轉(zhuǎn)換和A•T到G•C轉(zhuǎn)換)。

最值得注意的是，盡管xCas9可以在基因組中看到更多的網(wǎng)站，但它的錯(cuò)誤比自然的SpCas9更少。

“從科學(xué)角度來說，增加的特異性是最大的沖擊，”劉說。“盡管如此，我們推測，野生型Cas9的脫靶活性是一種保護(hù)性的適應(yīng)細(xì)菌以抵御不同變異的病毒 - 而且自然必須非常努力才能獲得完全正確的氨基酸組合，因此Cas9可以容忍一些不匹配。所以如果你足夠變異，這種酶可能會(huì)失去這種濫交。“

研究人員正在與其他實(shí)驗(yàn)室合作，以確定xCas9更高DNA特異性的分子基礎(chǔ)，并繼續(xù)使用PACE平臺(tái)進(jìn)化具有額外PAM兼容性的新酶變體。

“希望最終，我們將擁有一個(gè)Cas9或其他CRISPR酶解決方案的大書架，”劉說。“在我們能夠訪問人類基因組中的每個(gè)可能位點(diǎn)之前，我們在這一研究領(lǐng)域的努力從未真正結(jié)束。”