在一項對研究，醫(yī)學和工業(yè)產(chǎn)生重大影響的成就中，加州大學舊金山分校的科學家們已經(jīng)對人體免疫細胞進行了遺傳重編程，稱為T細胞而不使用病毒插入DNA。研究人員表示，他們希望他們的技術 - 采用CRISPR基因編輯技術的快速，通用和經(jīng)濟的方法 - 在新興的細胞治療領域被廣泛采用，從而加速開發(fā)新的和更安全的癌癥，自身免疫和其他治療方法。疾病，包括罕見的遺傳性疾病。

這種新方法描述于2018年7月11日出版的Nature，它提供了一種強大的分子“切割和粘貼”系統(tǒng)，用于重寫人類T細胞中的基因組序列。它依賴于電穿孔，這是一種將電場施加到細胞上以使其膜暫時更具滲透性的過程。在一年內(nèi)試驗了數(shù)千個變量后，加州大學舊金山分校的研究人員發(fā)現(xiàn)，當某些數(shù)量的T細胞，DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起，然后暴露在適當?shù)碾妶鲋袝r，T細胞就會在這些元件中，精確地將特定的基因序列整合到基因組中編程的CRISPR編程位點。

“這是一種快速，靈活的方法，可用于改變，增強和重新編程T細胞，因此我們可以為他們提供我們想要摧毀癌癥，識別感染或遏制自身免疫性疾病中過度免疫反應的特異性，”加州大學舊金山分校的Alex Marson，醫(yī)學博士，博士，微生物學和免疫學副教授，加州大學舊金山分校海倫迪勒家庭綜合癌癥中心成員，以及新研究的高級作者。“現(xiàn)在我們在所有這些方面都參加了比賽。”

但同樣重要的是新技術的速度和易用性，Marson，也是創(chuàng)新基因組學研究所的生物醫(yī)學科學主任說，這種方法可以將大量的DNA插入T細胞，這可以賦予T細胞細胞具有強大的新特性。Marson實驗室的成員使用電穿孔和CRISPR將一些遺傳物質(zhì)插入到T細胞中取得了一些成功，但直到現(xiàn)在，許多研究人員多次嘗試將長序列DNA置于T細胞中導致細胞死亡，導致大多數(shù)細胞死亡。相信大的DNA序列對T細胞過度毒性。

為了證明新方法的多功能性和功效，研究人員用它來修復患有罕見遺傳形式的自身免疫的兒童T細胞中的致病基因突變，并且還創(chuàng)建了定制的T細胞來尋找和殺死人類黑色素瘤細胞。

病毒通過細胞膜注射自己的遺傳物質(zhì)引起感染，自20世紀70年代以來，科學家利用這種能力，剝奪感染性病毒的病毒，并利用生成的“病毒載體”將DNA轉運到細胞中進行研究，基因治療，并在最近公布的例子，用于創(chuàng)建用于癌癥免疫療法的CAR-T細胞。

用病毒工程改造的T細胞現(xiàn)在被美國食品和藥物管理局批準用于對抗某些類型的白血病和淋巴瘤。但是，創(chuàng)建病毒載體是一項艱苦而昂貴的過程，臨床級載體的短缺導致基因療法和基于細胞的療法的制造瓶頸。即使可用，病毒載體仍遠非理想，因為它們將基因隨意插入細胞基因組中，這可能損害現(xiàn)有的健康基因或留下由監(jiān)管機制無法控制的新引入的基因，從而確保細胞正常運作。這些可能導致嚴重副作用的限制引起基因治療和細胞療法如基于CAR-T的免疫療法的關注。

“試圖將新基因?qū)隩細胞已有30年的努力，”第一作者Theo Roth說，他是一名攻讀醫(yī)學博士和博士學位的學生。加州大學舊金山分校醫(yī)學科學家培訓計劃的學位，他在Marson實驗室設計并領導了這項新研究。“現(xiàn)在不再需要六個或七個人在實驗室中使用病毒來設計T細胞，如果我們開始看到數(shù)百個實驗室設計這些細胞而不僅僅是少數(shù)，并且越來越多地工作復雜的DNA序列，我們將嘗試更多的可能性，它將顯著加快未來幾代細胞療法的發(fā)展。“

經(jīng)過近一年的反復試驗，Roth確定了T細胞群體，DNA數(shù)量和CRISPR豐度的比例，結合使用適當參數(shù)傳遞的電場，可以有效，準確地編輯T細胞。 '基因組。

為了證實這些發(fā)現(xiàn)，羅斯指示CRISPR用綠色熒光蛋白(GFP)標記一系列不同的T細胞蛋白，結果具有高度特異性，具有非常低水平的“脫靶”效應：每個亞細胞結構Roth的CRISPR模板設計用GFP標記，沒有其他人在顯微鏡下發(fā)出綠光。

然后，在設計用作新技術治療前景原理的補充實驗中，Roth，Marson及其同事展示了它如何潛在地用于整合T細胞對抗自身免疫性疾病或癌癥。

在第一個例子中，Roth及其同事使用由耶魯大學醫(yī)學院的醫(yī)學博士Kevan Herold提供給Marson實驗室的T細胞。這些細胞來自三個兄弟姐妹，患有罕見的嚴重自身免疫性疾病，迄今為止一直對治療有抵抗力?；蚪M測序顯示，這些兒童的T細胞攜帶一種名為IL2RA的基因突變。該基因包含對調(diào)節(jié)性T細胞或Tregs發(fā)育所必需的細胞表面受體的說明，其可以控制其他免疫細胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技術，UCSF團隊能夠快速修復兒童T細胞中的IL2RA缺陷，并恢復受突變影響的細胞信號。在CAR-T治療中，已經(jīng)從體內(nèi)移除的T細胞被設計為增強其抗癌能力，然后返回身體以靶向腫瘤。研究人員希望類似的方法可以有效治療Tregs發(fā)生故障的自身免疫性疾病，例如在三名患有IL2RA突變的兒童中看到的疾病。

在與加州大學洛杉磯分校Parker癌癥免疫治療研究所的Cristina Puig-Saus和醫(yī)學博士Antoni Ribas合作進行的第二組實驗中，科學家完全取代了正常人群中的天然T細胞受體。具有新受體的T細胞經(jīng)過專門設計以尋找人黑素瘤細胞的特定亞型。T細胞受體是細胞用于檢測疾病或感染的傳感器，并且在實驗室培養(yǎng)皿中，工程細胞有效地歸巢于靶向黑素瘤細胞而忽略其他細胞，表現(xiàn)出精確癌癥醫(yī)學的主要目標的那種特異性。

在不使用病毒的情況下，研究人員能夠生成大量經(jīng)過重新編程的CRISPR工程細胞，以展示新的T細胞受體。當轉移到植入人黑素瘤腫瘤的小鼠中時，工程化的人T細胞進入腫瘤部位并顯示出抗癌活性。

“這種替代T細胞受體的策略可以推廣到任何T細胞受體，”Marson說，他也是加州大學舊金山分校帕克癌癥免疫治療研究所和Chan Zuckerberg Biohub研究員的成員。“通過這種新技術，我們可以剪切并粘貼到指定的位置，重寫基因組序列中的特定頁面。”

Roth說，因為新技術可以在一周多一點的時間內(nèi)創(chuàng)建可行的定制T細胞系，它已經(jīng)改變了Marson實驗室的研究環(huán)境。由于病毒載體帶來的障礙，之前被認為過于困難或昂貴的實驗的想法現(xiàn)在已經(jīng)成熟，可供調(diào)查。“我們將研究20個'瘋狂'的想法，”Roth說，“因為我們可以非常快速地創(chuàng)建CRISPR模板，一旦我們有了模板，我們就可以將它放入T細胞并快速生長。”

Marson將新方法的成功歸功于羅斯的“絕對堅持”，面對人們普遍認為病毒載體是必需的，并且T細胞只能容忍小片DNA。“Theo確信，如果我們能夠找到合適的條件，我們就可以克服這些感知的局限性，并且他付出了巨大努力來測試數(shù)以千計的不同條件：CRISPR與DNA的比例;培養(yǎng)細胞的不同方式;不同的電流。通過優(yōu)化每個參數(shù)并將最佳條件放在一起，他能夠看到這個驚人的結果。“