轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2屬于ATP結(jié)合盒(ABC)家族。蛋白質(zhì)在多種組織和組織屏障內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)膜中表達(dá)，包括血腦，血睪和母胎屏障。蛋白質(zhì)可由ATP提供動力以轉(zhuǎn)移內(nèi)源底物，影響許多藥物的藥代動力學(xué)并防止多種異生素，包括抗癌藥物，尤其是乳腺癌。ABCG2通常被稱為乳腺癌耐藥蛋白，其中先前的研究揭示了ABCG2結(jié)構(gòu)和ABCG2抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)用小分子和抗體。ABCG2的底物識別機(jī)制以及ATP驅(qū)動的運輸能力仍有待確定。

在現(xiàn)在發(fā)表在Nature上的一份新報告中，Ioannis Manolaridis及其同事提出了人類ABCG2的高分辨率低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)，其基底結(jié)合前轉(zhuǎn)位狀態(tài)和ATP結(jié)合后易位狀態(tài)?？茖W(xué)家使用含有谷氨酰胺的突變蛋白代替催化谷氨酸(ABCG2 EQ)來觀察這兩種狀態(tài)。突變體ABCG2 EQ顯示降低的ATP酶和轉(zhuǎn)運速率，以使構(gòu)象捕獲適合于結(jié)構(gòu)研究。在研究的底物結(jié)合狀態(tài)中，在面向細(xì)胞質(zhì)的腔中大約穿過膜的一半，整合了單分子的雌酮-3-硫酸酯(E 1 S)用于功能研究。

由于ATP誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，樞轉(zhuǎn)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)和相對NBD亞結(jié)構(gòu)域方向的變化，觀察到跨膜結(jié)構(gòu)域的剛體移位。在其作用機(jī)制中，ABCG2利用ATP結(jié)合的能量來擠出E 1 S和其他內(nèi)源底物?；诨衔锏拇笮『徒Y(jié)合親和力，因此可以在研究中區(qū)分底物和抑制劑。

轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2屬于ATP結(jié)合盒(ABC)家族。蛋白質(zhì)在多種組織和組織屏障內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)膜中表達(dá)，包括血腦，血睪和母胎屏障。蛋白質(zhì)可由ATP提供動力以轉(zhuǎn)移內(nèi)源底物，影響許多藥物的藥代動力學(xué)并防止多種異生素，包括抗癌藥物，尤其是乳腺癌。ABCG2通常被稱為乳腺癌耐藥蛋白，其中先前的研究揭示了ABCG2結(jié)構(gòu)和ABCG2抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)用小分子和抗體。ABCG2的底物識別機(jī)制以及ATP驅(qū)動的運輸能力仍有待確定。

在現(xiàn)在發(fā)表在Nature上的一份新報告中，Ioannis Manolaridis及其同事提出了人類ABCG2的高分辨率低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)，其基底結(jié)合前轉(zhuǎn)位狀態(tài)和ATP結(jié)合后易位狀態(tài)?？茖W(xué)家使用含有谷氨酰胺的突變蛋白代替催化谷氨酸(ABCG2 EQ)來觀察這兩種狀態(tài)。突變體ABCG2 EQ顯示降低的ATP酶和轉(zhuǎn)運速率，以使構(gòu)象捕獲適合于結(jié)構(gòu)研究。在研究的底物結(jié)合狀態(tài)中，在面向細(xì)胞質(zhì)的腔中大約穿過膜的一半，整合了單分子的雌酮-3-硫酸酯(E 1 S)用于功能研究。

由于ATP誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，樞轉(zhuǎn)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)和相對NBD亞結(jié)構(gòu)域方向的變化，觀察到跨膜結(jié)構(gòu)域的剛體移位。在其作用機(jī)制中，ABCG2利用ATP結(jié)合的能量來擠出E 1 S和其他內(nèi)源底物?；诨衔锏拇笮『徒Y(jié)合親和力，因此可以在研究中區(qū)分底物和抑制劑。

作者首先確定用Walker B基序中的谷氨酰胺替代催化谷氨酸E211(磷酸鹽結(jié)合序列)將導(dǎo)致突變體大大減少(盡管未消除)ATP水解和E 1 S轉(zhuǎn)運活性。為了確定E 1 S結(jié)合結(jié)構(gòu)，將單克隆抗體5D3(5D3-Fab)的抗原結(jié)合片段添加到樣品中 - 其結(jié)合ABCG2的外表面，以促進(jìn)高分辨率結(jié)構(gòu)測定。在ATP水解減慢通過加入5D3-FAB的抑制脂質(zhì)體的重建ABCG2的和轉(zhuǎn)運活性，而不會影響ABCG2和E之間的相互作用1小號襯底。ABCG2 EQ 復(fù)合物顯示出內(nèi)部開放的構(gòu)象，總分辨率為3.6，以清楚地顯示跨膜結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合腔。

作者觀察到由ABCG2單體的底物結(jié)合腔中的跨膜(TM)螺旋TM2和TM5a形成的密度特征。密度特征可以在兩個方向上結(jié)合一個E 1 S底物，盡管由于多環(huán)體系的空間碰撞，兩個E 1 S分子不能同時結(jié)合。底物結(jié)合腔還可以容納抑制劑，證明其在底物和多藥結(jié)合中的雙重作用。

在這項研究中，科學(xué)家們?yōu)锳BCG2 EQ -E 1 S 產(chǎn)生了單點突變，以確定所得突變體變體的ATP酶活性和E 1 S轉(zhuǎn)運。所有測試的突變體的穩(wěn)定性顯示與天然野生型蛋白質(zhì)的相似性，允許直接比較。例如，V546F突變體具有受損的轉(zhuǎn)運活性，但ATP酶活性增加12倍，盡管E 1 S以濃度依賴性方式抑制。該結(jié)果表明，將兩個苯環(huán)引入底物腔中使得能夠與底物結(jié)合模擬ATP酶活性刺激，但進(jìn)一步包含E 1S'堵塞了'轉(zhuǎn)運蛋白'。其他突變體變體的結(jié)果與研究中的野生型蛋白質(zhì)相比有所不同，強(qiáng)調(diào)了結(jié)合腔對修飾的敏感性。

使用低溫-EM顯微術(shù)進(jìn)行的其他功能研究表明，ATP結(jié)合導(dǎo)致NBD(核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的α-螺旋結(jié)構(gòu)域旋轉(zhuǎn)35度以進(jìn)行二聚化，從而在運輸周期中實現(xiàn)“動力中風(fēng)”。在每個ABCG2單體中，單個跨膜核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域界面在無核苷酸和ATP結(jié)合狀態(tài)之間保持基本不變。然而，ATP誘導(dǎo)的構(gòu)象變化引發(fā)NBD的變化，導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)的細(xì)胞質(zhì)成分彼此推向。這種ATP誘導(dǎo)的構(gòu)象變化在底物轉(zhuǎn)運途徑中具有重要作用。

在結(jié)構(gòu)上處于ATP結(jié)合狀態(tài)的ABCG2 EQ -E I S中，苯環(huán)相互堆疊，使基板彎曲腔塌縮而沒有空間用于結(jié)合的基板。對于穿過膜的運輸，基質(zhì)必須在運輸器的中心移動通過易位通路，以在通路完全關(guān)閉之前到達(dá)外腔。對于該過程，必須發(fā)生類似蠕動運動的瞬時構(gòu)象變化以產(chǎn)生基板的空間。

作者假設(shè)底物可以通過細(xì)胞質(zhì)或通過脂質(zhì)雙層內(nèi)的“膜入口”結(jié)合。一旦結(jié)合，NBD二聚體只能在基質(zhì)移出基質(zhì)結(jié)合腔時關(guān)閉。在生產(chǎn)性運輸周期中，假定基質(zhì)通過“亮氨酸塞”在運輸者的中心移動通過易位途徑。一旦底物清除了插塞區(qū)域，ATP結(jié)合的ABCG2 EQ的結(jié)構(gòu)表明插塞區(qū)域閉合，并且底物被釋放到外部。

該研究的一個警告是，E211Q突變可能影響了所涉及的構(gòu)象變化的能量學(xué)。該發(fā)現(xiàn)表明ATP結(jié)合可能足以進(jìn)行底物擠出步驟，并且轉(zhuǎn)運蛋白可以通過ATP水解重置為面向內(nèi)的構(gòu)象。與其他轉(zhuǎn)運蛋白不同，ABCG2似乎在底物結(jié)合時不形成穩(wěn)定的，閉塞的構(gòu)象，但表現(xiàn)出類似于細(xì)菌BtuCD-F轉(zhuǎn)運蛋白的蠕動樣機(jī)制的瞬時構(gòu)象。

使用多特異性多藥轉(zhuǎn)運蛋白(如ABCG2)仍未解決的一個關(guān)鍵問題是為什么某些化合物作為底物，而其他化合物則作為有效的抑制劑。當(dāng)作者比較ABCG2底物與兩種有效抑制劑的結(jié)合模式時，所有三種分子都與轉(zhuǎn)運蛋白的同一腔結(jié)合。該研究進(jìn)一步表明，當(dāng)?shù)孜顴 I S和ATP一起結(jié)合ABCG2時，插塞的開口允許底物被推入外腔。相反，通過將結(jié)構(gòu)鎖定在面向內(nèi)的構(gòu)象中，抑制劑充當(dāng)楔子以固定轉(zhuǎn)運蛋白。該研究表明，化合物的大小和結(jié)合親和力對于轉(zhuǎn)運蛋白中的易位是重要的，從而允許區(qū)分底物和抑制劑。該工作為進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)運蛋白 ABCG2的動力學(xué)提供了新的見解。