杜克大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)工程師已經(jīng)開發(fā)出一種方法，可以將CRISPR基因組編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性平均提高50倍。他們相信它可以很容易地轉(zhuǎn)換為任何編輯技術(shù)不斷擴(kuò)展的格式。

該方法為引導(dǎo)RNA添加了短尾，其用于鑒定用于編輯的DNA序列。這種添加的尾部向后折疊并與其自身結(jié)合，形成“鎖定”，只能被靶DNA序列解除。

該研究于4月15日在線發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上。

“CRISPR通常具有令人難以置信的準(zhǔn)確性，但有一些例子表明了脫靶活動(dòng)，因此在整個(gè)領(lǐng)域?qū)υ黾犹禺愋杂袕V泛的興趣，”杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程魯尼家族副教授Charles Gersbach說。“但到目前為止提出的解決方案不能在不同的CRISPR系統(tǒng)之間輕松轉(zhuǎn)換。”

CRISPR / Cas9是一種防御系統(tǒng)，細(xì)菌用于靶向和切割入侵病毒的DNA。雖然第一個(gè)被設(shè)計(jì)用于人體細(xì)胞的CRISPR技術(shù)源自一種名為化膿性鏈球菌的細(xì)菌，但更多的細(xì)菌物種帶有其他形式。

該領(lǐng)域的科學(xué)家花了數(shù)年時(shí)間尋找具有所需特性的新CRISPR系統(tǒng)，并不斷添加到CRISPR庫(kù)中。例如，一些系統(tǒng)較小并且能夠更好地適合病毒載體內(nèi)部以遞送至人細(xì)胞用于基因治療。但無論他們的個(gè)人能力如何，所有人都有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不必要的遺傳編輯。

CRISPR系統(tǒng)的一個(gè)共同特性是它們使用RNA分子作為指導(dǎo)，其位于基因組中的靶DNA序列上。一旦指導(dǎo)RNA找到其互補(bǔ)的基因序列，Cas9酶就像剪刀一樣在DNA中切割，促進(jìn)基因組序列的改變。但是因?yàn)槊總€(gè)歸巢序列只有20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，而人類基因組含有大約30億個(gè)堿基對(duì)，所以需要排序很多，并且CRISPR有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，序列中有一個(gè)或兩個(gè)堿基對(duì)缺乏完美。

提高CRISPR準(zhǔn)確性的一種方法是需要兩個(gè)Cas9分子結(jié)合到相同DNA序列的相對(duì)側(cè)上，以進(jìn)行完全切割。雖然這種方法有效，但它會(huì)給系統(tǒng)增加更多部件，增加其復(fù)雜性并使其更難交付。

另一種方法是對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行基因工程改造，使其不那么精力充沛，因此不太可能跳槍并犯錯(cuò)誤。雖然這也顯示出有希望的結(jié)果，但是這種類型的蛋白質(zhì)工程是費(fèi)力的，并且這種努力對(duì)于每個(gè)CRISPR系統(tǒng)是特異性的。

“看起來幾乎每周都會(huì)發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR系統(tǒng)，它具有某種獨(dú)特的性質(zhì)，使其對(duì)特定的應(yīng)用非常有用，”Gersbach說。“每當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)新的CRISPR蛋白質(zhì)以使其更準(zhǔn)確時(shí)，進(jìn)行廣泛的重新設(shè)計(jì)并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的解決方案。”

“我們專注于不添加更多部件的解決方案，并且對(duì)于任何類型的CRISPR系統(tǒng)都是通用的，”負(fù)責(zé)該項(xiàng)目的Gersbach實(shí)驗(yàn)室的博士生Dewran Kocak說。“所有CRISPR系統(tǒng)的共同點(diǎn)是指導(dǎo)RNA，這些短RNA更易于設(shè)計(jì)。”

Gersbach和Kocak的解決方案是將引導(dǎo)RNA延伸多達(dá)20個(gè)核苷酸，使其折疊回自身并結(jié)合到原始指導(dǎo)RNA的末端，形成發(fā)夾形狀。如果在針對(duì)潛在切割進(jìn)行仔細(xì)檢查的DNA序列中即使單個(gè)堿基對(duì)不正確，也會(huì)產(chǎn)生一種非常難以置換的鎖定。但是因?yàn)橹笇?dǎo)RNA更喜歡與DNA而不是自身結(jié)合，DNA的正確組合仍然能夠打破鎖定。

“我們能夠?qū)︽i的強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)，以便指導(dǎo)RNA在達(dá)到正確匹配時(shí)仍能正常工作，”Kocak說。

在該論文中，Kocak和Gersbach表明，這種方法可以將來自四種不同細(xì)菌菌株的五種不同CRISPR系統(tǒng)的人體細(xì)胞切割的準(zhǔn)確度平均提高50倍。在一個(gè)案例中，改善上升到200多倍。

“這是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的想法，盡管Dewran完成了數(shù)年的研究，以證明它的工作方式與我們認(rèn)為它的工作方式一致，”Gersbach說。“這是一個(gè)很好的，優(yōu)雅的解決方案，可以擺脫脫靶活動(dòng)。”

展望未來，研究人員希望能夠看到這種方法可以使用多少種不同的CRISPR變體，并完整地深入表征鎖定機(jī)制如何工作以查看CRISPR變體之間是否存在差異。由于這些實(shí)驗(yàn)是在培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行的，研究人員迫切希望看到這種方法在實(shí)際動(dòng)物疾病模型中如何提高CRISPR的準(zhǔn)確性。