?144?JournalofMinimallyInvasiveMedicine,Apr.,2018,Vol.13,No.2

膠原水凝膠與基質膠作為骨組織工程支架

材料表面涂層修飾效果的比較研究▲

朱永佳12靳攀2何熠2繆志康2韋慶軍12*

(1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院；廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧市530021)

【摘要】目的對比研究膠原水凝膠和基質膠作為骨組織工程支架表面涂層材料的效果。

方法本實驗借助原代成骨細胞，通過對堿性磷酸酶(ALP)活性、組織學染及成骨特異性mRNA水

平的分析，研究膠原水凝膠和基質膠對成骨分化的影響。結果膠原組與基質膠組細胞活力以及增殖

能力均增強,并上調成骨相關基因及蛋白，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素（OCN)、骨橋蛋白（OPN)和

I型膠原蛋白（COL1A1),尤其是膠原水凝膠涂層對細胞生長和成骨分化的促進作用明顯大于基質膠

涂層。結論膠原水凝膠涂層比基質膠涂層更有利于成骨分化，更適合作為細胞支架,推薦其作為骨

組織工程支架材料的常用表面涂層材料。

【關鍵詞】膠原水凝膠;基質膠;成骨細胞;細胞表面支架

【中圖分類號】R602【文獻標識碼】A【文章編號】1673~6575(2018)024)1444)5

DOI：10.11864/.1673.2018.02.04

ZHUYongjia1，JINPan,HEYi，MIPOZhikang，WEIQingjun，2

(theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity；GuaagxiCollaborativeennovatiooCenterforBiormdi-

cine,Nanning，Guangxi530021，China')

【

Comparisonofmodificationeffectbetweencollagenhydrogelandmatrigelassurface

coatingofscaffoldmaterialsforbonetissueengineering

Abstract】ObjectiveTocomparethemodificationeffectbet-weencollagenhydrogelandmatrigelas

sThealkalinephosphatase(ALP)

activity,hitologicalstainingandmRNAlevelofosteogenicspecificgeneswereanalyzedintheprmar

osteoblasts,thentheeffectsofcollagenhydrogelandmatrigelonosteogenicdifferentiation

ResultsInthecollagengroupandmatrigelgroup，thecellvitalityandproliferativecapacityincreased，the

osteogenicrelatedgenesandproteinsincludingALP,osteocalcin,osteopontinandalpha1type

gwiththecollagenhydrogelpromotionwasmoreeffectiveinpromotingthecellgrowthand

sionCoatingwiththecollagen

hydrogelismorebeneficialtoosteogenicdifferentiationandismoresuitableforimprovementof

comparedtocoatingwithmatrigel，andisrecommendedasassurfacecoatingofscaffoldmatedalsforbone

tissueengineerng.

[Keywords】Collagenhydrogel;Matrigel；Osteoblast；Cellsurfacescaffold

骨缺損是骨科手術的挑戰(zhàn)。骨替代物，支架的作用

是創(chuàng)造細胞微環(huán)境進而模擬體內情況，并影響著增殖、

分化和凋亡等細胞過程的必要條件。天然骨組織包括

羥基磷灰石（HA)和膠原蛋白。目前膠原材料已引起人

們的廣泛關注且用于骨組織工程。I型膠原蛋白具有良

好的生物相容性，可作為大分子藥物緩慢釋放的載

體[^]，其制作方法包括礦化[3]、熱觸發(fā)組裝[4]、真空滲

▲基金項目：國家重點科技攻關計劃（編號：

2016YFB0700804);國家自然科學基金（編號：81472054);國家

自然科學基金（編號:81560371);廣西科技攻關項目發(fā)展基金

(編號:GuikeAB16450003);廣西高校高層次創(chuàng)新團隊和優(yōu)秀學

者（第三批）項目。

2通信作者

透[5]、凍干及超臨界點干燥[6]?；|膠，是一種基底膜

提取物，被廣泛應用于腫瘤轉移的研究中[]，其表面涂

前針對這兩種材料的比較研究尚未有報道。

本研究通過堿性磷酸酶檢測、組織學染以及

層可用于提高支架的成骨活性等生物學功能[84]，但目#$2018%第13'第2(

JournalofMinimallyInvasiveMedicine,018,3(2)

RT-PCR檢測成骨特異性基因的表達水不比較膠原水凝

數(shù)"

?145?

有限公司）進行細胞。最后用中性樹膠密封，用倒

置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.5ALP染和ALP活性測定按說明書分別用ALP

染試ALP檢測試

膠及基質膠的效果，以此來

涂層料。現(xiàn)報告如下。

的骨組織工

（均購自南成>

1材料與方法

，且后續(xù)操作均獲得廣

脫處死SD

工程研究所）進行2、4、6d堿性磷酸酶（ALP)染和

ALP細胞活性測定，觀察

1.1原代成骨細胞的分離提取3~7d日齡SD鼠

購自廣西醫(yī)科大學實驗動

鼠，

醫(yī)科大學倫理委員會批準。用

情況并用倒置相差顯微鏡

拍攝圖像。同時，用不含蛋白酶抑制劑（mM)的細胞

裂解液（RAPI)提取每個樣品的總蛋白，在12000rpm

離心15mi后，

標準液、顯

檢測吸光度值，隨后將值

3次。

1.6

養(yǎng)基的上用于檢測。加人試

后，用酶標儀在520nm處

成金氏單位，實驗重復

境下用布取出頂骨，浸于磷：

(PBS)中，然后用0.25%胰蛋-乙二胺四乙

(EDTA)U寶技術有限公司）在37°C消

化30mm除去結締組織及骨膜。將頂骨剪成1mm3的

碎片后，用I型膠原酶（Gibco,ThermoFisherScientific，

Inc..Waltham，MA，USA)37C下孵育4h。800g離心

茜素紅染培養(yǎng)2、4、6d后，用PBS洗滌細胞，

用4%多聚甲醛（PFA)固定30min,并在37°C用1mL

后，用

行像

除

。

料，用倒置相差顯微鏡進

5mi后，將細胞

Gico)和1%

于

/ft

10%(v/v))

溶液（（

(FBS，

100U/mL，鏈

0.1%茜素紅S(Sigma，USA，PH8.3)持續(xù)染30min。

霉素100U/mL)的培養(yǎng)基中，置于37°C5%C〇2培養(yǎng)箱

養(yǎng)，選擇第3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2水凝膠制備和細胞接種膠原水凝膠儲備液呈酸

性，不利于細胞。為得細胞的水溶

，化鈉溶人的凝膠儲

中至pH7.0?；|膠（BectonDickinson，USA)在4C環(huán)

境下融化至液態(tài)。在24孔板中加人20^L凝膠及在

6孔

胞養(yǎng)。

1.3細胞活性檢測細胞活性通過熒光素二乙酯

3次后，將細胞與2^M

(FDA，GenwayBiotechInc，USA)/鵬化丙陡（PI，Sigma，

USA)染檢測。用PBS;

FDA和2mg/LPI室溫避光環(huán)境中分別溫育5rmn，后通

1.7免疫組化檢測將細胞用4%多聚甲醛固定

酶，與在37^溫育30出1。|特結

30min,加人3%H2〇230min以消除內源性過氧化物

合。用I型膠原（1:100，Boter，武漢）抗體在4C孵育

用DAB孵育并用蘇木精復染后，將細胞風干，

封，并用置相差顯微鏡。

2

脂

后，加人Cy3-抗-兔IgG二抗（1:100，Boster，武漢）。

人100|xL凝膠，均于底部，待固化后，

在24孔板及6孔板分別接種2x104細胞及5x104細

1.8RNA的提取和qRT抗CR檢測用qRT-PCR檢測

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bmp2)、runt相關轉

(Runx2)、堿性磷（八1)、骨鈣素（0〇〇、骨橋蛋白

(Opn)和1

取試

蛋白（Colla1)的表達。使用RNA提

（Megentec,廣州）提取總RNA。從1pgRNA

開始，使用FastStartUniversalSYBRGreenMasterMix

((nvitrogen，CA，USA)擴增的逆轉錄試劑盒（Fermentas

見表1。通過使用比較2-AACt方

化為Gapdh。復3次

基

過激光共顯微鏡（LSCM，NikonA1，Japan)拍

像。

1.4細胞形態(tài)分析培養(yǎng)2、4、6d后，經多聚甲醛固定

30mi，并依次用蘇木精-伊紅（HE，南成技術

1

基因名稱

正向引物

Company,USA)合成2jxgcDNA。本實驗中使用的引物

達標準

少標準差。

PCR引物序列表

反向引物

Gapdh

Bmp2

RunX

Alp

Ocn

Opn

Colla1

1.9

5，-GGCTCTCTGCTCCTCCCTGT抗，

5，-CTGTGCCGTTGAACTTGCCG抗，

5，-GTGGCCAGGTTCAACGATCT抗'

5，-GTTACAAGGTGGTGGACGGT抗，

5，-GGCGCTACCTCAACAATGGA抗，

5，抗CACTCCTCGCCCTATTGGC抗，

5，抗GACCTCAAGATGTGCCACT抗，

2

2.1

5、TGCTCAGCTTCCATCACGAA兔，

5，抗ATITTGAGCTGGCTGTGGC兔，

5、TGAGGAATGCGCCCTAAATCA兔，

5，抗CAGTGGTCAAGGTTGGCTC兔，

5，-GGCAACACATGCCCTAAACG兔，

5，兔CATTGATACAGGTAGCGCCT

5，兔CATCGGTCATGCTCTCTCC兔，

結果統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0軟件進

行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差G±4表示，組

間比較使用單方差分析（AN0VA)和最小顯著差異

(LSD)進行分析。以P<0.05為差統(tǒng)計學意義。

細胞活性檢測通過FDAPI染測定細胞活性。

，死細胞成。與對如圖1所示，活細胞染成?146?JournalofMinimallyInvasiveMedicine,Apr.,2018,Vol.13,No.2

s

u

n

o)

s

.E

>

0

A

J

>

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o

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a>

d

>

l

10

v

l

a>

y

組相比，膠原組和基質膠組中發(fā)活的成骨細

胞，組活細胞明顯于基質組，明

成骨細胞活性具作用。

圖4空白組、基質膠組及膠原組成骨細胞內堿性磷酸酶活性

檢測（*代表尸<0.05，**代表尸<0.01，***代表尸<0.001)

圖1空白組、基質膠組及膠原組的FDA/PI染（活細胞

顯示綠，死細胞顯示

2.2

，200x)

細胞形態(tài)分析HE染觀察三組成骨細胞的形

(圖2)。細胞質染成，細胞成。隨時間

，各組成骨細胞數(shù)目，組細胞形態(tài)與

數(shù)目均優(yōu)于其他組。

圖2空白組、基質膠組及膠原組的HE染（200x)

2.3ALP染和ALP活性測定作為骨形成的標志

，ALP與成骨分化。組中ALP;度均隨

(見圖3)，組ALP;度明顯高于

組。ALP活第2天至第6天持續(xù)，在膠

組為明顯（見圖4)。ALP:結果分析

均表明凝成骨細胞的。

>

dP

_

圖3空白組、基質膠組組的堿性磷（200x)

2.4茜素使用來評估成骨細胞的

化結節(jié)，基質膠組組在第2天及第4天沒有發(fā)

明顯差異。然而，在第6天，與組和基質膠組相

比，膠原組明顯化作用，其產的礦化

結節(jié)（見圖5)。

圖5空白組、基質膠組組的（200x)

2.5免疫組化檢查I型膠原蛋白被認為是骨形成中

特的蛋白，本研究用免疫組織化學方法評估I

蛋白。結果顯示，膠原組比組呈明顯的陽性

結果

6

；同時，基質膠組中的陽達高于組（見

）。

1

|

祖

鈿

I

f粲

暍

稍

I

l

l

鏈

t

圖6空白組、基質膠組及膠原組的I型膠原免疫組化染

2.6

(200x)

基因表達分析成骨特異性基因AlP、〇cn和

Collal在蛋白組中明顯上調（見圖7)，表明

利于成骨;膠原組Collal的mRNA2018%第13'第2(

JournalofMinimallyInvasiveMedicine,018,3(2)

數(shù)?147?

4天到第6

達表明

源

的源分

相

涂層

引發(fā)

。

，本研究發(fā)現(xiàn)，與基質膠涂層比較，膠原水

利于骨形成且

涂層材料。

在骨組作

料，推薦其作為骨組織工

的

細胞分化，膠原蛋白的

導基因編蛋白

表明膠原可以通過外源性添加觸發(fā)內源基因編碼程序。

。實驗中檢測的基因

上

凝膠涂層

為細胞

材料常用

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.0

w.0

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'?*l

i

e

圖

(*

7Bmp2、Runx2、Alp、Ocn、Opn和Collal的相對表達情況

代表尸<0.05,**代表尸<0.01，***代表尸<0.001)

3討論

膠原水凝膠及基質膠均具有良好的生物相容性和

低的細胞毒性，有助于創(chuàng)造一個復雜的的細

胞微環(huán)境，作為表層細胞涂層使

用[7]。然而，目前還沒有研究比較它們對細胞成骨分化

的。

1所示，的推移，成骨細胞在涂

層比在基質膠涂層數(shù)量增加更顯著，demon丨

涂層在細胞生存方面比基質膠涂層[0]。與

FDATI染一致，更多的細胞聚集在涂層上，尤其

是第4?6天（圖2)。由成骨細胞產生并參與到天

磷的降解，為礦化的發(fā)生提供足夠的磷酸鹽

或磷，ALP通常作為成的標記來成

骨分化的程度[4]。圖3中的ALP染和圖4中的

ALP活性分析明在膠原組的ALP分泌，這

與圖7中Alp的mRNA—致。圖5顯示第6天的

化結節(jié)，證實種涂層方法的成骨效

應。I作為細胞外基質的主象，細

胞的附著、增殖和分化[1^4]。在圖6中，利用免疫組織

化學檢測到的I型膠原蛋，與圖7的基

達相一致。骨鈣素（Oc)和骨橋蛋白（Opn)都是成骨分

化的特征性標志物。Ocn是一種由成骨細胞分泌的特

蛋白，是骨細胞分化的標志[5]。Opn被認為是

細胞粘附，其分泌主要在骨形成的早期階

段[6]。7所示，Oc從第2天到第6續(xù)，而

Opn在第2天達值，與前期研究一致[5]。BMP-2信

號通路是調節(jié)骨再生的主要通路之一[17]，并通過BMP/

Smad信號通路調節(jié)Runx2的表達[1―測。本研究

中，膠原組BmP2和Runx2在第2天顯著上調了，并在第

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